泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡萄糖淀粉酶基因克隆及在酒精酵母中的表达与分泌

<正>泡盛曲霉(Aspergillus awamori)产生的葡萄糖淀粉酶是一种诱导的糖蛋白,它具α-1,4和α-1,6-D-glucan glucohydrolase活性,广泛用于需糖化淀粉的工艺.若将该酶基因导入啤酒酵母,构建能直接利用淀粉的酵母工程菌株,可省去淀粉液化和糖化的过程.国际上已有将泡盛曲霉的葡萄糖淀粉酶导入啤酒酵母的报道.该酶作用最适温度为60℃,对食用乙醇生产工艺较为有利.因此,我们用RT-PCR技术克隆了泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因,将其置于酵母烯酸酶(Enolase)启动子(Promotor)和终止子(Terminator)之间,构建了表达载体,转化非营养缺陷型酒精酵母AS.2.1364,获得能将淀粉转化为葡萄糖并可发酵产生酒精的转基因酵母菌株.     

曲霉淀粉酶的纸上电泳分离及测定

我们曾比较研究了几株酒精工业上常用的曲霉淀粉酶的性质,观察到黄曲霉Asp.oryzae与黑曲霉Asp.batatae及白曲霉(黑曲霉Asp.niger的浅色变种)的淀粉水解酶体系有显著的区别:黄曲霉富含α-淀粉酶(糊精化酶);黑曲霉富含糖化酶,此种糖化酶兼有淀粉糖化力(相当β-淀粉酶)和麦芽糖分解力(相当麦芽糖酶)。在不同的条件下处理或用硫酸铵分段沉淀法,都不能将这两种活性区分开来,故     

乙型肝炎表面抗原基因在啤酒酵母中的表达

用基因工程的方法研制乙型肝炎疫苗已引起广泛注意。我们在HBsAg互补脱氧核糖核酸(cDNA)及乙型肝炎病毒DNA克隆成功的基础上使HBsAg在啤酒酵母中得到表达。实验用启动子是从一含酵母磷酸葡萄糖酸激酶(PGK)基因的质粒pSBP-1加工得来的,该质粒所含的PGK基因长度为3.0kbp左右,内外各有一个限制性内切酶EcoR I切点。为     

N-糖基化引起葡萄糖淀粉酶不同型的差异

红曲霉葡萄糖淀粉酶具有多型性,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上有5条蛋白带(E_1——E_5) E_3,E_4,和E_5均为糖蛋白,含糖量分别为7%和9%.用ConA-Sephafose分高纯化红曲霉葡萄糖淀粉酶时,被α-甲基D-葡萄糖苷依亲和力由小到大的顺序将E_3,E_4和E_5洗脱下来,也说明他们的含糖量E_5>E_4>E_3.糖肽之间的连结方式除O-糖苷键外,还有N-糖苷键、我们试图用内切或外切糖昔酶切去糖链,以查明糖基化对多型性的影响.     

用YEPD丰富培养基筛选酵母PR03~+转化子的方法

1979年Brandriss首次分离到啤酒酵母的三株脯氨酸生物合成酶基因的突变型,并且发现凡是酵母脯氨酸缺陷株都不能在丰富培养基(YEPD)上生长。过了二年才搞清楚,这是由于啤酒酵母的脯氨酸转运系统受到丰富培养基中大量铵离子的阻遏而造成的。     

液体曲曲霉深层培养试验

我们用液体法培养曲霉,进行了选种及最适生长条件的试验。兹将结果简报于下.1.选种:先把我室保存的几百株曲霉用麸皮培养,进行选择,得到糖化力强的黄曲霉24株及黑曲霉12株。再把这些菌株进行液体培养,选择适于液内生长且糖化力强者。选择菌种时用了三种培养基:察氏液,以2%淀粉代替蔗糖的察氏液及2%白藷干 0.4%NaNO_3 自来水。培养时用的摇床,振速60     

抗癌酶制剂——L_天门冬酰胺酶

1953年Kidd发现豚鼠血清有抗肿瘤作用,1961—1963年Broome证实豚鼠血清的抗肿瘤因子是血清中的L-天门冬酰胺酶,后来陆续发现L-天门冬酰胺酶在生物界分布甚广。某些微生物所产生的L-天门冬酰胺酶也有抗肿瘤作用。1.L-天门冬酰胺酶高产菌株的筛选我们从87株细菌中筛选获得L-天门冬酰胺酶的高产菌株大肠杆菌(Escherichia coli)AS 1.357。采用7.5—10％玉米浆培养基     

嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆和表达的研究

α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1.)是通过内切α-1,4-葡糖苷键降解淀粉而使其粘度下降的一种酶.在商品生产过程中,这种酶有广泛的用途,例如,在酒精、啤酒酿造和制糖工业中淀粉的减薄和液化.在纺织工业中,它用于染色之前的织物退浆.耐热性α-淀粉酶具有良好的热稳定性,反应温度高,因而能充分利用     

用双杂交系统发现与CPP32相互作用的新型分子的初步研究

作为ICE蛋白酶家族的一员 ,CPP32 (又称Yama ,Apopain)在许多形式的凋亡途径中起极其重要的作用 .为研究调控CPP32的分子 ,本文运用酵母双杂交系统杂找与CPP32相互作用的分子 .首先将CPP32基因克隆到 pGBT9质粒载体中 ,得到的重组质粒命名为pGBT9/CPP .然后将 pGBT9/CPP转化酵母菌HF7C ,再导入人白血病文库质粒 ,用营养缺陷培养基 (TrpLeuHis)初步筛选文库中插入cDNA所编码的序列与CPP32相互作用的菌落 ,再进一步检测 β 半乳糖苷酶活性 .我们共得到 4 2个在营养缺陷培养基上生长的菌落。β_半乳糖苷酸活性检测表明 ,只有 5个菌落在显色底物X_gal的存在下变蓝色 .提取该 5个阳性酵母菌落的质粒 ,电击转化E .coliHB10 1.提取文库质粒 ,经酶切鉴定、重新转化及序列测定后发现 ,与CPP32相互作用的分子为一新型 15肽 ,推测它可能是与CPP32相互作用的结构域     

两种拮抗菌β-1, 3-葡聚糖酶和几丁酶的产生及其抑菌的可能机理

膜醭毕赤酵母（Pichia membranefaciens Hansen)和季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii)是两株能有效抑制桃、油桃果实采后软腐病的拮抗菌。研究了拮抗菌的β－1，3－葡聚糖和几丁酶活性在in vitro和in vivo上的诱导。结果表明，以葡萄糖＋细胞壁制品（CWP）作为碳源时在Lilly-Barnett基本培养基中诱导的β－1，3－葡聚糖活性最高，其中膜醭毕赤酵母和季也蒙假丝酵母的最高值分别达114.0 SU(specific activity unit,比活单位）和103.2SU，而以葡萄糖作为惟一碳源时诱导的β－1，3－葡聚糖活性则最低。在Czapeck基本培养基中，膜醭毕赤酵母诱导的几丁酶（外切及内切几丁酶）活性显著地高于季也蒙假丝酵母，如膜醭毕赤酵母外切几丁酶最大活性达3.13SU，显著地高于季也蒙假丝酵母的最大活性（2.24SU)。酵母菌悬浮液和碳源也能诱导桃果实伤口处β－1，3－葡聚糖和几丁酶的产生。研究表明β－1，3－葡聚糖和几丁酶在抑制病菌时都有一定作用，并可能具有协同效果。     

链霉菌M1033同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株的构建

为实现有工业生产价值的葡萄糖异构酶双突变体酶ＧＩ（Ｇ１３８Ｐ－Ｇ２４７Ｄ）的稳定高效表达，在建立７号淀粉酶链霉菌Ｍ１０３３原生质体转化条件的基础上，构建了含６００ｂｐ不完整ＧＩ（Ｇ１３８Ｐ－Ｇ２４７Ｄ）结构基因片段的插入型同源重组质粒ｐＸＷ，并通过同源重组模式整合到Ｍ１０３３的染色体上，实现了ＧＩ基因的破坏（ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ），获得了同源重组葡萄糖异构酶缺陷型菌株。对同源重组片段的分     

人神经生长因子β亚基的基因在P.pastoris和E.coli中的表达

将hNGFB基因插入甲醇营养性酵母P .pastoris分泌表达载体pHIL S1和E .coli表达载体pET 15b中 ,相应转化P .pastorisGS115 (Mut+,His- )和E .coliBL2 1(DE3 ) .在不含组氨酸平板上生长的酵母转化子通过PCR进一步筛选阳性克隆 ,P .pastoris重组菌株的蛋白电泳表明发酵液中有特异表达带 ,扫描分析占细胞外泌总蛋白的 14 .4% ,Westernblotting证实该分泌蛋白具有hNGF的免疫活性 .E .coli重组菌株在IPTG的诱导下表达融合蛋白 .电泳扫描分析表达的融合蛋白占细胞总蛋白量的 10 .3 % ,Westernblotting检测表明具有免疫活性 .     

酿酒酵母菌共表达XYLA和XKS1发酵木糖生产酒精

分别从腾冲嗜热菌 (Thermoanaerobacter tengcongensis MB4T)和毕赤酵母(Pichia stipitis)中克隆到木糖异构酶基因(xylose isomerase gene, XYLA)和木酮糖激酶基因(xylulokinase gene, XKS1). 共表达这2个基因的重组菌EF1014不仅可以在以木糖为惟一碳源的培养基上生长, 而且在厌氧条件下能发酵木糖生产酒精. 在不同温度下用不同浓度的木糖分别进行的发酵实验表明, 当木糖浓度为50 g/L时, 酒精的产量达到最大值0.11 g/g 木糖. 与此同时, 28.4%的木糖被利用, 并产生1.54 g/L 的木糖醇. 当发酵温度从30℃提高到37℃时, 酒精产量没有明显变化.     

用基因重组α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造

α-半乳糖苷酶是进行B→O血型改造的工具酶. 采用RT-PCR方法, 从中国海南Catimor咖啡豆中克隆了全长1.1 kb的α-半乳糖苷酶cDNA, 并构建了其表达载体. 电穿孔法将载体导入毕赤酵母GS115细胞, 筛选出重组(-半乳糖苷酶菌株. 离子交换层析纯化出α-半乳糖苷酶, 酶比活性从15 U/mg 提高到28.14 U/mg. 进一步鉴定了酶的生物化学性质, 其Km = 0.275, Vmax = 0.014 mmol@L-1@min-1. 据此确定了B→O血型改造的条件: pH 5.5~5.6, 每毫升红细胞使用100 U α-半乳糖苷酶, 26℃, 4 h. 经动物输血实验初步证明, 酶解反应后的通用O型血(enzymatically converted group O red blood cells, ECORBC)是安全的.     

酶法体外建立天冬氨酸酶基因的随机突变库

L-天冬氨酸酶(EC 4.3.1.1)是一种重要的工业用酶,用于酶法生产L-天冬氨酸。近年来,全世界对L-天冬氨酸的需要量稳定增长,因此,对该酶的理论与应用研究已引起广泛的重视,1984年Guest等报道了E.coli K-12菌株的天冬氨酸酶基因的克隆;1985年了akagi等报道了E.coli W菌株的天冬氨酸酶基因的克隆和核苷酸顺序,克隆株比原始菌株的酶活力提高2—3倍;1986年Woods等报道了E.coli K-12菌株的天冬氨酸酶的氨基酸顺序.并将含有天冬氨酸酶基因的质粒转化E.coli 294中,细胞酶活力提高约30倍;     

水稻bZIP蛋白REB与水稻中sbe1和waxy基因5′上游区的相互作用

水稻淀粉分支酶(SBE1)和结合淀粉粒的淀粉合成酶(GBSS)分别负责水稻胚乳中支链淀粉与直链淀粉的合成, 编码这两个酶的sbe1和waxy基因主要都在胚乳中表达. 在水稻sbe1基因5′上游区中找到了一个能与水稻胚乳核蛋白结合的53 bp片段C53, 而且这种结合受到水稻waxy基因5′上游区的Ha-2片段竞争. 进一步的实验证明水稻bZIP蛋白REB可以结合sbe1基因中C53片段中的2个ACGT元件G-box和Hex, 并且REB也能结合waxy基因中Ha-2片段的3个ACGT元件: WG1, WG2和WG3, 其中WG1元件能强烈地竞争Hex元件与REB蛋白的结合. 这提示水稻sbe1基因与waxy基因在胚乳中的表达受到像REB这样的bZIP类转录因子的协同调控.     

不同声压下酒精水溶液中的单泡声致发光

测量了不同浓度酒精水溶液中单泡声致发光随驱动超声声压大小变化关系曲线. 结果表明, 根据光强-声压(I-P_a)曲线的变化关系, 可以把酒精浓度分为3个区域. (1) 在较低浓度时, 随着酒精浓度的增加, 曲线往低声压方向移动, 驱动声压变化较大; 相同声压下, 单泡声致发光的发光强度随酒精浓度增加而增加. (2) 当酒精浓度稍高时, 驱动声压变化较小; 相同声压下, 单泡声致发光光强随酒精浓度的增加而降低. (3) 进一步增加酒精浓度, 光强随酒精浓度变化关系趋势在不同声压下的关系不同, 但I-P_a曲线的斜率随酒精浓度的增加而降低. 可以通过气泡动力学以及酒精的物理化学性质解释这些结果, 同时这些结果也有助于进一步了解单泡声致发光的发光机制.     

黄瓜花叶病毒复制酶基因的克隆及其植物表达载体的构建

黄瓜花叶病毒(CMV)是一种正链RNA病毒,在全世界分布很广,至少可侵染85科365属中的757种植物.将经过改造的CMV复制酶基因导入植物,可获得比导入外壳蛋白基因等抗性水平高、时间长的工程植株.本文首次报道了中国株系CMV复制酶基因的克隆及其核苷酸序列,构建了3’末端不同长度缺失的植物表达载体.     

phbB基因在莱茵衣藻中的表达与分子检测

通过构建依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶基因(phbB)的衣藻表达载体, 用石英砂VOTEX转化技术, 将phbB基因导入细胞壁缺陷的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii cc-849)中, 用含有10 μg/mL的Zeomycin的平板培养基进行筛选和实验室保持培养, 得到了表达phbB基因的转基因藻株. PCR和Southern blot结果显示phbB基因已整合到莱茵衣藻基因组中. RT-PCR与DNA杂交的检测结果显示, 导入的phbB基因在衣藻中具有转录活性.     

细菌Ⅱ型分泌途径控制产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes) S2中卵磷脂酶的分泌

从水稻根际分离筛选出1株降解卵磷脂的有机磷降解细菌菌株S2, 通过形态指标、生理生化性状、16S rDNA序列、(G+C)含量以及DNA-DNA杂交分析, 鉴定为产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes). 采用双亲接合的方法将带有Tn5转座子的质粒导入产碱假单胞菌S2菌株中进行转座子插入诱变, 从5000个卡那霉素抗性的Tn5插入突变株中, 筛选到3株丧失解磷能力的突变株(M808, M1329和M1400)和1株解磷能力增强的突变株(M20). 对Tn5插入位点的基因进行DNA测序表明, 丧失解磷能力突变株中被突变的基因分别是xcpS, xcpX和xcpW, 它们分别编码XcpS, XcpX和XcpW蛋白, 这些蛋白是细菌Ⅱ型分泌途径中的主要成分. 将xcpS, xcpX和xcpW基因分别构建在pLAFR3载体上, 通过双亲接合的方式分别导入上述M808, M1329和M1400三个丧失解磷能力突变株中进行功能互补实验, 结果表明这3个基因都能使各自相对应的突变株恢复解磷能力. 以上结果表明, 在产碱假单胞菌中卵磷脂酶的分泌是通过Ⅱ型分泌途径来完成的. 解磷能力的丧失可能是由于Tn5插入xcp基因簇中的某一基因破坏了卵磷脂酶向胞外的分泌, 造成突变株不能降解有机磷. 在解磷能力增强突变株M20中, 被突变的基因与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PAO1中的chpA基因(参与细菌的颤动)同源性达88%.