一个新的人类硫氧化还原蛋白基因的克隆

根据不同发育阶段 ( 1 3,33周 )的人胎脑组织mRNA差异显示分析 (又称DDRT PCR)所得到的具有差异表达的EST的序列 ,设计引物筛选点阵排列的人胎脑cDNA文库 ,得到一个新的全长cDNA克隆 .这个克隆全长 1 2 0 8bp ,包含一个 889bp的开放阅读框 ,一个 1 32bp的 5′非翻译序列和一个 2 0 9bp的 3′非翻译序列以及典型的polyA加尾信号 .其推断的氨基酸序列与人硫氧化还原蛋白同源 ,而且含有硫氧化还原蛋白的保守的活性位点序列 .将它命名为人的类硫氧化还原蛋白基因 (humanthioredoxinlikegene ,hTRXL) .     

春化相关基因ver203FcDNA3′末端的克隆及序列分析

以差异筛选技术克隆到的春化相关基因cDNAverc2 0 3为基础 ,设计 5′端引物 ,利用RACE克隆策略 ,通过RT PCR扩增得到cDNA的 3′未端序列ver2 0 3F(1197bp) .Northernblot分析表明其全长约为 2 .0kb ,且其表达具有春化处理的特异性 .检索表明该基因序列(AB0 12 10 3)与一大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性 .推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径 .     

促甲状腺激素释放激素受体基因在小鼠睾丸中的表达

促甲状腺激素释放激素(Thyrotropin-releasing hormone,TRH)为Shally等人于1969年从羊和猪的下丘脑中提取并分离纯化的3肽。TRH与垂体前叶促甲状腺激素细胞特异性受体结合刺激促甲状腺激素(TSH)的合成和分泌。应用免疫组织化学,TRH定位于睾丸内间质细胞中,且TRH基因也已在人、大鼠和小鼠的睾丸中表达。然而,TRH是否通过特异性受体作用于睾丸仍不清楚。目前,编码TRH受体(TRH Receptor,TRH-R)的cDNA克隆已从小鼠垂体促甲状腺激素肿瘤细胞中分离出来,其氨基酸序列显示TRH-R是由7个跨膜区的单一肽链构成,属G蛋白偶联型受体超家族。大鼠和小鼠的TRH-R的核苷酸和氨基酸序列具有高度同源性。TRH可能通过G蛋白偶联受体起到内分泌和神经药理作用。Satoh等人通过Northern印迹杂交和反转录-PCR发现小鼠、大鼠和人的睾丸组织中特异性表达了TRH-R基因,但无定位结果。本文应用原位杂交组织化学(ISHH)技术,首次观察了TRH-R mRNA在小鼠睾丸中的表达和定位,现报道如下:     

山羊β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1, 2及内含子1在内的乳腺表达载体, 并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因. 鼠尾静脉注射实验表明, 该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达. 应用显微注射方法将该融合基因导入小鼠受精卵, 并将受精卵移植于假孕母鼠, 共获得33只F0代小鼠, 经PCR和Southern印迹杂交证实, 有8只小鼠(5♀, 3 ♂ )基因组中整合有hALB基因, 整合率为24.2%(8/33). Western blot分析表明, 在5只雌性整合小鼠中有3只表达了hALB蛋白, 放射免疫法测定其乳汁中hALB含量分别为3.54, 0.21和3.03 g/L.     

玉米Cat1基因顺式元件ABRE2结合蛋白ABP9的基因克隆及功能分析

构建了授粉后17d(17dpp)的玉米幼胚cDNA基因文库，用玉米Catl基因顺式元件ABRE2通过酵母单杂交的方法筛选文库，获得3个完全相同的阳性克隆，命名为ABP9，用5′RACE的方法得到了该基因的全长cDNA序列，研究结果表明，ABP9属于bZIP类转录因子，与玉米Catl基因顺式元件ABRE2具有结合特异性，且在酵母细胞中具有转录激活功能。     

棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆

采用功能筛选策略从以PVX病毒载体建立的棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae) cDNA文库中克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段). 以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA文库, 采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana), 从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆. 对上述阳性克隆进行序列测定和分析, 结果显示, 其中7个与已知的基因具有较高的同源性, 其中PBC43编码一个特异的elicitin蛋白; PBC163编码一个Rab蛋白, 与大豆疫霉的RAB同源性较高; PBC241编码抗增殖蛋白(prohibitin); PBN62编码一个热激蛋白60 (HSP60). 还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因, 提示可能是该病原菌特异的激发子基因. 上述结果表明, 利用病毒表达载体构建cDNA文库, 用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生过敏反应的激发子基因, 该方法可望为其他植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台.     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离及其启动子功能分析

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

JUN和FOS基因增加水稻prolamin 4a基因的表达

水稻prolamin基因的表达具有发育(开花后种子成熟过程中)和组织(胚乳)的特异性,是研究基因表达调控的理想材料。目前,关于水稻prolamin cDNA和13,10kD prolamin的基因已经定序,而对其表达特异性在分子水平上的机理,尚未见报道. 周先锦、范云六报道了prolamin 4a基因启动子的序列并在转基因烟草植株中证实了该启动子的发育和组织特异性表达功能。该启动子属于13kD prolamin基因启动子,具有与     

苜蓿根瘤菌nod C蛋白生化特性的分析

根瘤菌的共同结瘤基因nod A,B和C,具有高度的保守性。这些基因对诱发宿主根毛的卷曲和根瘤早期的形成起重要作用.比较苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)和碗豆根瘤菌(R. Leguminosarum)结瘤基因的DNA序列,由此得出nod C蛋白(Nod C)的氨基酸顺序同源性达95％。最近开始对结瘤蛋白生化功能的研究表明,Nod C的结构同细胞表面受体非常类似。     

金鱼母体因子β-catenin cDNA的克隆及在胚胎发育中的作用

核质相互作用一直是动物胚胎发育领域的研究焦点, 母体因子对于脊椎动物胚胎发育的启动具有决定性作用. 在已有的研究中, 直接研究母体因子β-catenin基因的时空表达规律与其功能的相关性还较少见, 因此, 我们对该基因在金鱼胚胎发育全程中的作用进行了时空性的跟踪研究. 报道了金鱼β-catenin cDNA全基因序列, 并与斑马鱼的β-catenin cDNA序列和氨基酸序列进行了比较, 结果表明, 两者具有很高的同源性, 分别为93% (2227/2384 bp)和98.5% (768/780 aa); 系统地研究了β-catenin基因在金鱼胚胎发育全过程中的表达规律; 用反义RNA和绿色荧光蛋白基因共注射技术, 直接活体考察了β-catenin基因活性对金鱼胚胎发育的影响. 结果证明, β-catenin在胚胎中的分布是动态的, 主要定位于体轴和背部组织, 以及头尾结构. β-catenin活性的丧失, 导致胚胎背部结构严重缺损和沿前后轴组织发育受阻, 并在幼体形成前死亡, 说明该基因是胚胎启动和发育的必要因子之一.     

一个猪免疫球蛋白IgG H链基因的克隆、序列分析及表达

用RT PCR方法从猪脾脏中分离到一段 1 42 5bp的DNA片段 ,该片段编码免疫球蛋白基因 .经全序列分析证明此片段与前人报道的序列有较高同源性 ,其C区属于猪Igγ链基因亚类 3.用EcoRⅠ和NsiⅠ切点将该片段切下插入pET 3b(NSEB) ( - )中 ,表达出约 5 2ku的蛋白质 ,表达量约为 2 1 % .     

豌豆EF-1α的cDNA克隆、全序列及结构特征分析

以赤霉素 (GA)处理后的G2豌豆为材料 ,构建了一个 2 .0× 1 0 6的cDNA文库 ,用随机筛选法从该文库中得到一个 1 6 6 7bp的cDNA ,其 5′端非编码区长 1 0 0bp ,3′端非编码区长 2 2 3bp ,拥有一个 1 34 4bp的开放读码框 ,共编码 447个氨基酸 .DNA及报道的蛋白质序列同源性分析表明 ,它编码了豌豆延伸因子 1α(elongationfactor 1 alpha ,EF 1α) ,其功能区段具有很高的保守性 ,可应用于分子进化研究     

PAS结构域介导Org35蛋白与NifA之间相互作用

在巴西固氮螺菌中, 氧和铵是调节固氮基因表达的主要环境因子, 即高浓度的氧和铵抑制固氮作用. NifA蛋白(nifA基因的产物)是所有固氮基因(nif基因)的转录激活蛋白. 目前, 在该菌中, 氧和铵对NifA蛋白的表达和活性的调节机制仍然不清楚. 本研究从巴西固氮螺菌中克隆到编码含有PAS结构域蛋白的org35全基因, 将根据org35的核苷酸序列推测的Org35蛋白氨基酸序列在NCBI网上进行同源性比较, 结果表明, Org35蛋白属于杂合双组分调节系统, 包括3个结构域, 即N-端PAS结构、中间组氨酸激酶结构域(HPK)和C-端响应调节蛋白结构域(RR). 并通过酵母双杂交系统证明了Org35蛋白与NifA蛋白之间的相互作用是由PAS结构域介导的.     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

人核受体nr5a2(hb1f)基因组序列的生物信息学分析

在克隆了人核受体基因nr5a2(hb1f )的cDNA的基础上, 测定了该基因的全基因组序列. 采用生物信息学手段对nr5a2(hb1f )基因组序列进行了深入分析. 序列同源性比较及编码序列预测结果提示, 在测定的210 kb基因组序列中,特别是人nr5a2(hb1f )基因的内含子中可能还存在其他的编码信息. 通过比较基因组方法分析不同生物nr5a基因的结构, 发现各种生物nr5a基因的结构具有保守性, 并且在进化过程中有明显的基因重复现象. 对斑马鱼、小鼠和人nr5a2基因上游序列的比较, 显示这些生物nr5a2基因的启动子区域相当保守, 提示不同生物的nr5a2基因可能受到同一类转录因子的调控.     

豌豆乙酰羟酸还原异构酶基因的cDNA克隆及其表达

用cDNA差示分析法从G2豌豆总RNA中筛选到一个GA3特异诱导表达的基因片段,用该片段作探针进一步筛选G2豌豆cDNA文库,得到一个全长2036bp的cDNA序列。经分析,该cDNA含有一个1746bp的可读框,编码的蛋白质含有581个氨基酸,理论分子量为64ku,cDNA及推导的氨基酸序列分别与不同来源的乙酰羟酸还原异构酶相应序列有较高的同源性。将该基因转入表达载体中并在大肠杆菌中表达,获得了具有显著酶活性的外源蛋白。     

NPA motif在水通道蛋白AQP1表达和转水功能中的重要性

水通道蛋白(AQP)序列中的两个天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸序列(NPA motif)是水通道蛋白家族中高度保守的特征性序列, 其晶体结构研究显示, 两个NPA motifs位于通道中心的狭窄部位, 直接参与水分子的结合和选择性通过. 为了进一步研究两个NPA motifs在水通道蛋白结构、功能和生源学(biogenesis)方面的重要性, 通过点突变方法分别获得单独缺失NPA1或NPA2 motif以及同时缺失两个NPA motifs的3种水通道AQP1基因突变型. 将3种AQP1突变cDNA分别亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1, 建立稳定转染3种AQP1基因突变型的CHO细胞系. AQP1免疫荧光分析显示, 3种AQP1突变蛋白均能正常表达并定位于质膜, 显示AQP1蛋白质表达和细胞内加工过程未受NPA motifs缺失的影响. 分别对表达3种AQP1突变蛋白的CHO细胞进行质膜水通透性功能分析, 并与表达野生型AQP1的CHO细胞进行比较, 结果显示, 缺失NPA1或NPA2引起AQP1转水功能下降49.6%和 46.7%, 而同时缺失两个NPA motifs的AQP1转水功能与野生型AQP1相似. 上述结果显示, 水通道AQP1中的NPA motifs在AQP1转水功能中发挥重要作用, 但对于AQP1蛋白的表达、细胞内加工和通道基本结构的形成并不起关键作用.     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)mRNA5′端非翻译区(UTR)对其表达的调控

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在人体纤溶与凝血的平衡调控中发挥重要作用,而且在治疗心血管栓塞性疾病方面具有广阔的应用前景.t-PA在人体内的表达受严格调控,其mRNA具有较长的非翻译区序列.我们曾报道了t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的调控,为研究长约209nt的5′-UTR序列对t-PA表达的影响.本文采用反转录-PCR技术从黑色素瘤细胞中克隆出t-PA cDNA 5′端序列,在体外和体内2个系统中研究了5-′UTR序列对t-PA表达的影响.     

金鱼母体因子β-catenin cDNA的克隆及在胚胎发育

核质相互作用一直是动物胚胎发育领域的研究焦点, 母体因子对于脊椎动物胚胎发育的启动具有决定性作用. 在已有的研究中, 直接研究母体因子β-catenin基因的时空表达规律与其功能的相关性还较少见, 因此, 我们对该基因在金鱼胚胎发育全程中的作用进行了时空性的跟踪研究. 报道了金鱼β-catenin cDNA全基因序列, 并与斑马鱼的β-catenin cDNA序列和氨基酸序列进行了比较, 结果表明, 两者具有很高的同源性, 分别为93% (2227/2384 bp)和98.5% (768/780 aa); 系统地研究了β-catenin基因在金鱼胚胎发育全过程中的表达规律; 用反义RNA和绿色荧光蛋白基因共注射技术, 直接活体考察了β-catenin基因活性对金鱼胚胎发育的影响. 结果证明, b-catenin在胚胎中的分布是动态的, 主要定位于体轴和背部组织, 以及头尾结构. b-catenin活性的丧失, 导致胚胎背部结构严重缺损和沿前后轴组织发育受阻, 并在幼体形成前死亡, 说明该基因是胚胎启动和发育的必要因子之一.