酵母α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

酵母编码α-半乳糖苷酶的基因MEL1被扩增并克隆到表达载体pRSET中,重组质粒pRSET-Gal转化至相应的受体菌BL21（DE3)）PlysS,阳性克隆经液体培养和IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析,在50kD处有一目的分子大小的亮带,裂解细菌后经X-α-Gal的显色底物反应,液体变蓝．试验表明：α-半乳糖苷酶基因MEL1在大肠杆菌中得到了表达,糖基化对于维持此酶的生物活性不是必须的。     

Paenibacillus sp.K1 α-半乳糖苷酶酶学性质

利用CODEHOP PCR和Anchor-ligated PCR方法从类芽孢杆菌Paenibacillus sp.K1中克隆得到一个α-半乳糖苷酶基因aga P1,大小为2 190 bp,同源性分析显示,该基因与其他α-半乳糖苷酶基因的序列相似低,是一个新的α-半乳糖苷酶基因。将aga P1在大肠杆菌Origami B(DE3)中表达并纯化获得Aga P1,酶学性质分析显示:以p NPG为底物时,Aga P1最适反应温度为40℃,最适p H 6.5~10,Km值为0.75 mmol/L,最大反应速率Vmax为1.96μmol·min-1·mg-1。同时Fe2+、Mg2+、Ca2+、K+和甘油能使α-半乳糖苷酶酶活提高1~3倍,而Cu2+、Zn2+、Fe3+和还原型谷胱甘肽则抑制该酶的活性。SDS-PAGE检测Aga P1蛋白大小约为80 ku,与理论预测值基本一致;Native-PAGE分析表明正常条件下Aga P1蛋白以二聚体或六聚体形式存在。以上结果显示,Paenibacillus sp.K1产生的α-半乳糖苷酶为一个新的低温α-半乳糖苷酶。     

温泉来源地芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以Geobacillus sp.WQJ-1基因组DNA为模板,利用PCR扩增获得成熟α-淀粉酶基因amy WQJ,构建重组质粒p ET-28a(+)-amy WQJ,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达.用镍柱亲和层析对粗酶液进行分离纯化,获得相对分子质量约为59 ku的重组酶r Amy WQJ.研究表明,该酶最适pH值为6.0,具有较好pH稳定性,最适温度为70℃;Ca~(2+)能提高该酶的热稳定性;Hg~(2+)、EDTA、SDS、Cr3+、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)对该酶活力具有不同程度的抑制作用,而Co~(2+)、Na+和β-Mercaptoethanol则具有促进作用.以可溶性淀粉为底物,该酶动力学参数Km为6.62 mg·m L-1,vmax为2 197.80μmol·(mg·min)-1;降解最适作用底物木薯淀粉的终产物为寡聚糖.     

酿酒酵母α-半乳糖苷酶基因重组菌株的表达分析

PCR扩增里氏木霉(Trichoderma reesei)2个α-半乳糖苷酶基因agl2和agl3,将其分别与表达载体pY-ES2连接,电转化酿酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)INVScl菌株.从重组菌株提取载体进行单酶切凝胶电泳检测,证实agl2和agl3分别在重组菌株AGL2和AGLs表达.以葡萄糖和棉子糖为碳源培养菌株,2株重组菌的生长速率均显著高于原始菌株,提前8h菌数达到最大,其中以AGL3的生长速率提高较为明显,重组还使菌株在液体培养基由原来的部分絮凝转变为完全游离状.2株重组菌株均不能利用蜜二糖为碳源生长.     

产热稳定α-半乳糖苷酶菌株的筛选及酶活力的初步研究

利用选择性培养基从发霉的豆粕、豆油工厂周围环境中取样并分离纯化获得一株产热稳定性α-半乳糖苷酶耐热真菌,通过形态学和分子生物学鉴定方法初步鉴定该菌株为分枝犁头霉.研究表明该菌株生长的最适温度和pH值是47℃和7.0,所产酶为胞内酶.酶活研究表明粗酶液的最适温度和pH值分别为68℃和7.0,具有较好的热稳定性.     

短双歧杆菌(Bifidobacterium breve 203)α-D-半乳糖苷酶的诱导合成及部分酶性质研究

研究发现 2 5株所试肠道细菌中只有 6株双歧杆菌可以利用棉子糖良好生长 ,并且在棉子糖的诱导下产生α D 半乳糖苷酶 .9种不同糖中 ,Bifidobacter iumbreve 2 0 3可以利用葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖良好生长 ,但只有蜜二糖和棉子糖诱导α D 半乳糖苷酶的产生 .1 0mmol/L的棉子糖和蜜二糖对于α D 半乳糖苷酶的诱导合成是最佳浓度的 ,且此浓度下 ,棉子糖的诱导能力 (比活 7.1 3units/mg)是蜜二糖 (比活 3 .4 0units/mg)的 2倍以上 .B .breve 2 0 3菌株α D 半乳糖苷酶专一性水解α D 半乳糖苷键 ,不水解β D 半乳糖苷键 .酶反应的最适温度是 3 7℃ ,酶在 4 0℃以下稳定 ,60℃时剩余 80 %的酶活 ,65℃时剩余 2 0 %的酶活 ,70℃时失去所有的酶活 .酶在 pH5.5～ 9.5稳定 ,酶反应的最适pH是 5.5～ 6.5.Hg 、Cu2 、Ag 和PCMB强烈抑制酶的活性 ,而Co2 、Mg2 、Ca2 、Mn2 、Zn2 、EDTA和DTT对酶活性没有抑制 .     

产α-半乳糖苷酶乳酸菌的鉴定及其发酵性能研究

从传统乳制品中筛选到2株高产α-半乳糖苷酶的菌株,经菌株形态和生理生化特性鉴定以及16S rRNA基因序列分析,确定为发酵乳酸杆菌和长双歧杆菌,并命名为LB21和KLDS2.0509。同时研究了2株菌在豆乳中的酶活力、产酸性能、棉子糖降解能力和蛋白水解能力。菌株LB21和KLDS2.0509表现出不同的α-半乳糖苷酶活力,其最高酶活力分别为26.8U/mL和31.5U/mL,发酵终点pH分别为5.1和5.0,两者均能有效地降解棉子糖,蛋白水解能力随着发酵时间的增加而增强。     

Paenibacillus sp.K1 β-半乳糖苷酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从鲜牛奶中分离到1株产β-galactosidase的细菌,经16S rDNA序列比对鉴定为类芽孢菌Paenibacillus sp. K1。提取该菌株的染色体DNA,以pUC18（lac-）为载体,构建其DNA文库;在含有X-gal的LB平板上筛选该文库,得到6个蓝色菌落;对阳性克隆中插入的DNA片段序列测定,鉴定出1个编码全长为2028bp并携带有组成型启动子的β-半乳糖苷酶基因。将该基因导入大肠杆菌BL21（DE3）中,实现了β-半乳糖苷酶高效表达,其酶活为25.06U/mL,高于原始菌株的4.55U/mL,并进一步用亲和层析将该酶进行了纯化。     

常现青霉(Penicillium frequentans)β-半乳糖苷酶的纯化及其性质

从常现青霉麸曲中抽提的β-半乳糖苷酶(E.C.32。1.23,亦称乳糖酶)粗制品,经两次硫酸铵盐析沉淀和DEAE纤维素柱层析,纯度提高了近55倍,纯化酶的最适反应温度为62～65℃,最适反应pH为4.0。于pH2.2～8.0放置过夜,酶活性基本稳定。以邻硝基苯酚β-半乳糖苷(ONPG)为底物时该酶的K_m为2.06 mmol/L。Cu~(++),Fe~(++)和N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)对酶活性有明显的抑制作用,Mn~(++)为该酶的激活剂。     

按回路α-对角占优矩阵的讨论

首先定义了按回路弱不可约α_2-对角占优矩阵,给出了按回路弱不可约严格α_2-对角占优矩阵的一个等价表征,进而利用矩阵对角占优理论得到了非奇异H-矩阵的若干判定条件,进一步丰富和完善了按回路α-对角占优矩阵与非奇异H-矩阵的理论。     

π-群强半格的同余

一个半群是Clifford半群当且仅当它是群的强半格,π-群是群在π-正则半群范围内的推广.同余是研究半群性质和结构的重要手段和工具.研究了π-群的强半格上的正则同余,并给出了π-群强半格上的同余是正则同余的充要条件.     

β-半乳糖苷酶诱导条件的研究

从市售不同品牌的普通酸奶中分离出6株乳杆菌,分别编号为YB1、YB2、YB3、YB4、YB5、YB6。通过镜检、革兰氏染色、过氧化氢酶反应、糖发酵反应等初步鉴定为保加利亚乳杆菌。对其一株菌产β-半乳糖苷酶的条件进行优化研究,采用乳糖进行不同浓度的诱导,结果表明当乳糖浓度为1.00%时的诱导效果较好;IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)是一种乳糖类似物,也可诱导菌株产生β-半乳糖苷酶,且其终浓度为0.8mM时的诱导效果较好;对两种诱导剂进行诱导效果的比较,表明应用0.8mM的IPTG可达到最佳诱导效果。     

嗜热芽孢杆菌β-半乳糖苷酶发酵条件研究

以嗜热芽孢杆菌为菌种,研究发酵生产β－半乳糖苷酶的条件。应用均匀设计法优化发酵培养基组成,结果为（ｇ／Ｌ）：乳糖０．５、蛋白胨２．０、牛肉浸膏２．０、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０１。在温度５５℃、初始ｐＨ７．０、摇床转速２００ｒ／ｍ ｉｎ 和１０％ 接种量条件下,发酵２４ｈ,β－半乳糖苷酶酶活力达１３．２Ｕ／ｍ Ｌ。在乳糖水解反应中,证实该酶能催化转半乳糖苷反应,合成半乳糖低聚糖。     

重组杆状病毒的研究 Ⅰ.含大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的粉纹夜蛾核型多角体病毒

以昆虫杆状病毒(Baculovirus)为载体、昆虫虫体和昆虫细胞为受体的基因工程,是目前正在开拓的富有前途的新领域之一.杆状病毒载体系统的优点在于:对外源基因的容量大;病毒基因组能提供一个可插入外源基因而对病毒复制本身不受影响的非必需区(多角体基因),同时提供一个极强的启动子,使植入的外源基因能高效表达;能大规模低成本地饲养寄主昆虫,从而有可能大量获得具有重要经济价值的外源基因表达产     

响应面法优化菌株Serratia proteamaculans sp. L 3产冷活性β-半乳糖苷酶

为了开发工业用酶,在前期菌株筛选的基础上,利用Design-Expert软件,通过Plackett-Bru-man设计与响应面法(RSM)相结合的实验统计方法实现对Serratia proteamaculans sp.L 3菌株产冷β-半乳糖苷酶培养基成分的优化.Plackett-Burman设计筛选出3个显著影响因子:K2HPO4,MgSO4和NaCl,应用中心组合设计和响应面分析确定产酶的最优组合为:K2HPO40.15 g·L-1,MgSO40.50 g·L-1,NaCl 0.76 g·L-1,此时预测的最高A420为0.370 4.经过验证实验,结果表示最佳产酶培养基成分条件下,优化后降解ONPG的能力提高了1.1倍.本研究为微生物β-半乳糖苷酶的后续工业化应用提供理论依据.     

产转糖基β-半乳糖苷酶菌株F3的鉴定、产酶条件及转糖基活性研究

菌株乃从土壤中筛选得到,具有产生转糖基β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的特性。根据形态观察及18S rDNA序列分析;菌株乃被鉴定为扩张青霉（Penicillumexpansum）。通过单因子试验和正交试验,对菌株乃产生转糖基阻半乳糖苷酶的培养基组成及发酵条件进行了优化。优化后的培养基组成为葡萄糖2％、酵母粉1％、蛋白胨1．5％、氯化钠0．3％。在初始pH6．0,28℃培养40h时,其产酶量为2245．2U／L,比优化前提高约3倍。菌株乃产生的转糖基肛半乳糖苷酶以pH4．5缓冲液配制的30％乳糖为底物,50℃反应24h,低聚半乳糖产量为30．6％,其中80％以上为三糖。     

含α，β-不饱和酮的新的环金属钌配合物的合成及其对HSO3-的识别

将 4-(2-吡啶基) 苯乙酮与 3-醛基-7-N, N-二乙基氨基香豆素缩合反应, 获得了具有α,β-不饱和酮结构的C,N-配体(1) ,再将该配体与[Ru(cycme) Cl₂]₂和 2,2''-二联吡啶反应, 得到了具有 α,β-不饱和酮的环金属钌配合物(2) ,并通过¹H NMR, MS 和紫外-可见吸收光谱表征了其结构．结果表明: 该配合物的最大吸收峰位于 475 nm,其摩尔消光系数达到 5.2×10⁴ mol^-1 ·L·cm^-1 ; 在 PBS 缓 冲溶液中, 可选择性识别 HSO₃^-, 对 HSO₃^-检测限为37 μmol /L.     

α-琼胶酶OUC-GaJJ96的异源表达及酶学性质

琼胶酶在功能性琼胶寡糖的酶法制备中发挥着重要作用,目前有关α-琼胶酶的研究较少。克隆表达了来自溶藻性吉尔维菌(Gilvimarinus agarilyticus)的α-琼胶酶,命名为OUC-GaJJ96,并对其酶学性质及水解产物进行研究。该酶属于糖苷水解酶96家族,基因全长为3759bp,编码1252个氨基酸,N端含有26个氨基酸编码的信号肽,蛋白分子质量约为180kDa。酶学性质研究显示:OUC-GaJJ96最适反应温度和最适反应pH值分别为30℃和7.0(Tris-HCl缓冲液),比酶活力为2.68U/mg。通过高效液相色谱和电喷雾离子源质谱对OUC-GaJJ96的水解产物进行分析,结果表明:该酶水解产物是琼二糖、琼四糖和琼六糖,其中琼四糖是主要产物,OUC-GaJJ96可用于制备具有生物活性的琼胶寡糖。     

乳酸克鲁维酵母(Kluveromces lactis)β-半乳糖苷酶的稳定性研究

探讨了乳酸克鲁维酵母（Ｋ．Ｌａｃｔｉｃ）β－ 半乳糖苷酶金属离子稳定性和热稳定性．证明某些金属离子对β－半乳糖苷酶具激活作用,另一些金属离子对β－半乳糖苷酶活性影响不大,但是在高浓度的条件下均表现出对酶活性不同程度的抑制作用．Ｃａ２＋ 对酶的抑制可以被磷酸盐、脱脂乳以及Ｍｇ２＋ ,Ｍｎ２＋ 所恢复．Ｋ＋ 单独存在就可以大大地提高酶的热稳定性,Ｍｎ２＋ 可以增加Ｋ＋ 对β－半乳糖苷酶的热稳定性作用,而Ｍｇ２＋ ,Ｍｎ２＋ 和Ｎａ＋ 自身不能提高酶的热稳定性．甘油、脱脂乳均可以提高酶的热稳定性,脱脂乳成分如乳糖、酪蛋白酸钠对酶的热稳定作用有赖于Ｋ＋ 的存在