克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇代谢途径中的酶活变化

考察了不同条件下克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella.pneumoniae)合成1,3-丙二醇(1,3-PD)的3种关键酶(甘油脱氢酶(GDH)、1,3-PD氧化还原酶(PDOR)及甘油脱水酶(GDHz))的表观酶活变化。结果显示:这3种酶的酶活变化与Klebsiella.pneumoniae的1,3-PD代谢不完全相关。用SDS-PAGE电泳分析上述不同发酵条件下酶活变化,结果显示不同于3种酶的蛋白条带,Mr约为4.0×104位置的蛋白条带有明显的变化,这可能与菌体代谢过程相关,结论有待进一步深入研究。     

克雷伯杆菌1,3-丙二醇氧化还原酶的分离纯化及其酶学性质

在有氧条件下,利用DEAE Sepharose Fast Flow弱阴离子离子交换层析和Blue Sepharose CL-6B亲和层析,同时分离并提纯克雷伯杆菌胞内的1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱氢酶.研究表明,1,3-丙二醇氧化还原酶的纯化倍数为35.86倍,回收率为5.17%,该酶最适表观反应温度为57 ℃,最适反应pH值为9.5.在30 ℃及pH=8.0～10.0时,该酶具有良好的稳定性.在45 ℃和pH=9.5条件下,该酶以1,3-丙二醇和NAD+为底物,其米氏常数Km分别为15.8,0.2 mmol·L-1.1,3-丙二醇氧化还原酶对生理反应底物3-羟基丙醛活性最大,对其他醇类也有氧化能力.Mn2+对酶有显著激活作用,巯基保护剂能明显提高酶的活力.     

甘油发酵生产1,3-丙二醇的菌种筛选

本实验室从上海地区的活性污泥中分离得到能使甘油转化产生1,3-丙二醇的细菌,经过初步筛选和GC-MS分析鉴定,得到一株转化率较高的菌株,随后对其发酵条件和培养基成分进行初步的探索,确定了较为优化的培养基配方．此菌株的甘油转化率达到47．3％．     

1,3-丙二醇的脱盐工艺

1,3-丙二醇（1,3-Propanediol,简称1,3-PD）是重要的溶剂和化工原料,主要用于合成聚酯,聚氨酯等可生物降解材料。本文讨论采用化工工业传统的沉淀法除去发酵液中的盐类物质,同时可回收各种副产品,产生增值效应。     

微生物转化法生产1,3-丙二醇的研究进展

综述微生物转化法生产1,3-丙二醇(1,3-PD)的研究进展,包括发酵菌种和发酵工艺等.生物转化法生产1,3-PD与化学法相比,具有选择性好、转化率高、分离纯化简单、无污染、利用可再生资源等优点.要使生物转化法生产1,3-PD能与化学法竞争,在提高1,3-PD发酵生产水平的同时,必须有效降低生产成本.以生物柴油副产物废甘油为发酵底物生产1,3-PD,可大大降低1,3-PD生产成本,同时解决废甘油高附加值利用的问题,延长产业链.但存在的问题是废甘油成分复杂,抑制了微生物的生长和代谢.     

1,3-丙二醇-甘油汽液相平衡数据的推算

针对由甘油,1,3-丙二醇组成的体系,推算其在低压下的汽液相平衡数据。利用UNIFAC基团贡献法计算液相活度系数。提供了该二元体系于lOOkPa,50kPa和lOkPa下的汽液相平衡数据。结果显示,两组分不会形成共沸物,而且系统压力越低,越利于它们的分离。     

两阶段控制甘油浓度提高1,3-丙二醇发酵水平

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)分批发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD),根据菌体生长、产物生成和补料可将发酵过程分成4个阶段.不同阶段控制不同的底物浓度会对菌体生长和产物生成产生不同的影响.研究发现,菌体生长阶段(阶段Ⅱ)底物浓度控制在6.0 g/L最适合菌体生长,产物主要生成阶段(阶段Ⅲ)底物浓度控制在18.9 g/L最适合产物生成,菌浓可达7.83 g/L,最终1,3-PD的浓度为68.5 g/L,摩尔转化率为61%,生产强度为2.21 g/(L·h).     

耐高浓度甘油的1,3-丙二醇生产菌的诱变选育

利用紫外线对克雷伯杆菌进行诱变,筛选出耐高浓度甘油且1,3-丙二醇(1,3-PD)产量较高的突变株KpⅥ.实验结果表明,在距离34 cm,功率30 W的紫外灯垂直照射下,最佳紫外诱变时间为6 min,此时,致死率为90.9%.克雷伯杆菌经过紫外诱变后,菌落明显增大,是原始菌株的2~4倍;变异菌株KpⅥ经过6代遗传稳定性考察,甘油消耗率和1,3-PD产量稳定,且保持了较高水平.在甘油质量浓度为90 g.L-1的条件下,变异菌株KpⅥ的甘油消耗率为98.3%,甘油转化率为50.4%,1,3-PD产量为44.81 g.L-1,生产能力达到0.75 g.(L.h)-1.     

丙烯醛水合加氢制1,3-丙二醇的研究

考察了丙烯醛水合及3-羟基丙醛加氢制1,3-丙二醇的工艺条件。在装有阳离子交换树脂催化剂的固定床层反应中,当ACR的质量分数为12~15%,反应空速为5~6h-1,反应温度为50℃,并加入少量对苯二酚阻聚剂时,ACR的单程转化率为80%,3-HPA的选择性可达87.5%。在高压釜进行3-羟基丙醛加氢催化剂筛选。结果表明使用四元合金制备的Raney Ni催化剂,在一段加氢温度为45℃,二段加氢温度为120℃,氢气压力为6MPa,搅拌转速500r.min-1时,3-HPA的转化率≥98%,产物1,3-丙二醇收率接近100%。。     

乳酸菌的分离和鉴定及其1,3-PDO的活性测定

从红原取样的酸奶中分离出7株乳酸菌,根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》,依据细菌的菌落特征、菌体形态、生理生化特性初步鉴定这7株乳酸菌分别属于乳球菌属,链球菌属,乳杆菌属.并且通过1,3-丙二醇氧化还原酶活性检测,发现其中一株具有活性.     

1,3-丙二醇脱氢酶三级结构的模建

利用生物大分子数据库及生物信息学技术,对来源于Klebsiella pneumoniae的1,3-丙二醇脱氢酶分子进行二级结构预测、多序列联配．实验发现,其具有较保守的铁离子结合位点,而未发现常见的NAD(H)结合位点．在此基础上,利用同源建模法和穿线法模建该酶的三级结构,进一步发现铁离子结合位点在空间上形成一口袋状结构．探讨对其作用机制,同时发现该序列中存在2个含铁元素的乙醇脱氢酶信号．     

重组PDOR基因的表达与纯化及部分酶学性质

将dhaT在E.coli BL21(DE3)pLysS中进行表达,并对含有His6标记的1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)进行纯化.重组PDOR反应的最适pH值为10.0,最适温度为55℃,其以1,3-丙二醇和NAD+为底物的表观米氏常数Km值分别是15.5,0.23 mmol*L-1.实验表明,Ca2+, Mg2+和Cu2+对酶活性有抑制作用,而Fe2+, Na+, NH+4和Mn2+对酶活性有促进作用;1,3-丙二醇是PDOR适合的氧化底物.     

固定化双菌串联发酵生产1，3-丙二醇

以葡萄糖为底物,利用分别固定化的酵母Candida krusei ICM-Y-05和肺炎杆菌Klebsiella pneumoniae ZJU 5205串联发酵生产1,3-丙二醇。实验结果表明,由C.krusei发酵而得粗甘油只需经简单离心后即可被K.pneumoniae所利用。将C.krusei包埋于NaCS/PDMDAAC生物微胶囊中,并于气升式反应器中发酵,所得发酵液直接流入固定床反应器,同时向固定床反应器补充微量元素,发酵培养经NaCS/PDMDAAC生物微胶囊包埋的K.pneumoniae,产物即为1,3-丙二醇。三批次发酵实验结果表明,1,3-丙二醇/葡萄糖的最终摩尔转化率为0.295。     

不同胁迫下盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因表达及其与甘油合成的响应

在已克隆的盐藻（Dunaliella salina）3-磷酸甘油脱氢酶GPD基因的基础上,利用实时荧光定量PCR的方法,研究了经高盐、厌氧、磷酸盐以及氧化等不同外界胁迫条件下该基因的表达情况,并同时监测了盐藻细胞甘油合成的动态变化.对比酿酒酵母的GPD基因,发现D.salina GPD基因受高渗诱导,同时D.salina细胞内可能存在多个形式的GPD基因.     

酿酒酵母GPDH1基因表达载体pPIC3.5K-ScGPD的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

将酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1的编码序列构建到表达载体pPIC3．5K中,利用电转化法将构建好的表达载体转入巴斯德毕赤酵母中,利用含有G418的YPD平板筛选到两个阳性转化子,通过分子生物学及外源蛋白表达实验证明,酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDH1已经整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,并且得到了预期的表达。     

盐藻3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆

采用Ｌａｍｂｄａ置换型载体ＥＭＢＬ３构建了盐藻基因组文库,文库大小为１．８×１０４,插入片段大小为１０～２０ｋｂ,从盐藻基因组文库中获得３个３－磷酸甘油脱氢酶基因的阳性克隆,斑点杂交证实了原位杂交的真实性