甘蓝型油菜BnDHAR基因的克隆及表达分析

在甘蓝型油菜矮化突变体与其高秆亲本构建的消减杂交文库中,得到一长约230bp与编码脱氢抗坏血酸还原酶的DHAR基因核苷酸序列相似的DNA片段.采用同源克隆技术,在甘蓝型油菜中获得该基因的全长cDNA序列,命名为BnDHAR.BnDHAR与已公布的甘蓝型油菜基因组中的该基因核苷酸序列完全一致.对BnDHAR基因不同发育时期组织的表达分析的结果显示,BnDHAR基因在高秆油菜苗期的叶中表达量最高,是矮化突变体的5倍,在根、茎中表达极低,具有组织特异性.非生物胁迫显著影响BnDHAR表达,高温胁迫使其表达升高,盐胁迫处理9h时达最高,而干旱胁迫时表达量在处理12h时才达最高.     

白菜型油菜核育性相关基因片段的克隆与序列分析

通过ＲＡＰＤ标记,所获得的与育性基因紧密连锁的基因片段进行克隆与序列分析,结果表明,该育性基因片段为与油菜小孢子发育早期ＢＰ４调控基因５８％同源,并含有一ＭＡＰＤＳ盒高度同源的保邓列。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明该基因为单拷贝基因。     

甘蓝型油菜BnBRI1基因的克隆及表达分析

以拟南芥油菜素内酯受体BRI1基因序列设计同源简并引物,利用同源克隆技术,克隆了甘蓝型油菜中编码油菜素内酯受体基因全长cDNA序列,命名为BnBRI1(GenBank:JX871217),该基因开放阅读框(ORF)大小为3591bp,与拟南芥中BRI1基因(GenBank:NM_120100)相似性为94.21%,编码1196个氨基酸,与拟南芥中BRI编码的氨基酸相似性为89.23%.采用实时定量PCR分析表明,BnBRI1基因在根、茎、叶中都有表达,但表达量存在显著差异.在两叶一心期和花期的根中表达量最高,四叶一心期和抽薹期的叶中表达量最高.     

油菜MAP激酶基因BnMPK6基因的克隆及表达分析

从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAP激酶基因BnMPK6,全长1521 bp,其中包括1185 bp的开放阅读框,81 bp的5′非翻译区(5′UTR),255 bp的3′非翻译区(3′UTR).与拟南芥AtMPK6同源性达86.9%,因此命名为BnMPK6(GenBank登录号为HQ156228).该基因编码394个氨基酸的蛋白质,分子量44.8 kDa,等电点为5.13.实时荧光定量PCR结果表明该基因表达量随着低温胁迫时间的增长而增高,说明BnMPK6基因受低温胁迫诱导表达.     

甘蓝型油菜BnbHLH92基因的克隆与表达分析

为研究甘蓝型油菜bHLH转录因子的功能,采用同源克隆技术从甘蓝型油菜中克隆了5个BnbHLH92基因全长cDNA序列,分别命名为BnbHLH92-1、BnbHLH92-2、BnbHLH92-3、BnbHLH92-4、BnbHLH92-5,其编码区长度分别为738,657,684,741,717bp.qRT-PCR实验表明,除BnbHLH92-1外,其它的BnbHLH92基因主要在抽薹期和花期的根中表达,BnbHLH92-1主要在抽薹期和花期的根以及二叶一心期的叶中表达.非生物胁迫显著影响BnbHLH92基因的表达,使其表达量升高.低温胁迫下,BnbHLH92基因分别在胁迫后4、6、6、6、6 h表达量达最高.高温胁迫下,5个BnbHLH92基因分别在胁迫后2、6、6、8、4 h表达量达最高.盐胁迫下,BnbHLH92基因分别在胁迫后6、6、24、24、24 h表达量达最高.在ABA诱导下BnbHLH92基因表达量也有不同程度的增加,分析发现BnbHLH92基因的启动子序列上存在ABA响应元件(ABRE).     

不结球白菜耐热相关基因BcPLDγ的克隆和表达分析

以不结球白菜耐热自交系‘高华青’、‘苏州青’和热敏自交系‘矮脚黄’为试验材料,利用RACE技术克隆得到不结球白菜BcPLDγ基因,利用生物信息学方法对该基因进行信息学分析,并采用qRT-PCR技术对热胁迫处理条件下不结球白菜叶片BcPLDγ基因的表达模式进行了研究.结果显示,BcPLDγ基因的cDNA全长为2736bp,其中开放阅读框长度为1905bp,共编码634个氨基酸.该蛋白不存在信号肽序列,预测相对分子量为71.59kD,理论等电点为6.73.BcPLDγ蛋白的二级结构主要由α-螺旋、延伸直链、β-转角和无规则卷曲4种形式构成.该蛋白含有一个植物PLD特有的C2结构域和一个PLDc结构域.系统进化分析表明BcPLDγ蛋白与同属植物的进化关系相近,其中与甘蓝型油菜进化关系最近.热胁迫处理条件下,3份试验材料中BcPLDγ基因表达均显著上调,并于12h时达到峰值,且上调趋势与试验材料的耐热性呈正相关.     

甘蓝型油菜CCCH基因BnaA07g26050D的克隆及表达分析

油菜是我国重要的油料作物,它的产量受到各种逆境胁迫的影响.我们之前的研究表明,拟南芥CCCH锌指蛋白At C3H14控制植株生长发育的诸多过程.在本研究中,我们证实甘蓝型油菜CCCH基因Bna A07g26050D(At C3H14的同源基因)响应盐胁迫和干旱胁迫.Bna A07g26050D蛋白C端包含两个串联的CX8CX5CX3H结构域,在酵母中具有转录激活活性,类似于At C3H14.将Bna A07g26050D融合GFP转化拟南芥原生质体,发现其主要定位于细胞质和P-body中.qRT-PCR检测Bna A07g26050D基因的组织表达模式,结果表明该基因主要在上部茎、根和花中大量表达,而在其他组织中表达较低.此外,qRTPCR证实Bna A07g26050D基因在盐胁迫和干旱胁迫下表达量都明显上调,证明该基因可能参与干旱和盐胁迫.我们的研究为利用基因工程技术培育耐盐、旱油菜新品种提供了基因源.     

甘蓝型油菜独脚金内酯相关基因的克隆与表达分析

独脚金内酯(strigolactones,SLs)是一类新鉴定的植物激素,参与抑制茎分枝.采用同源克隆技术自甘蓝型油菜中得到了三个SLs相关基因,分别命名为BnMAX4,BnMAX1和BnD14,其CDS各长1707,1593,804bp,推测编码的蛋白质功能分别为β-类胡萝卜素加氧酶,细胞色素P450,α/β水解酶.RT-qPCR表达分析显示在野生型甘蓝型油菜二叶及四叶一心期的各组织器官中,BnMAX4主要在二叶一心期的根中表达;BnMAX1无明显表达优势组织;BnD14在二叶一心期的叶中高表达.旱胁迫及盐胁迫处理时BnMAX4的表达趋势为骤降;BnMAX1旱胁迫处理时表达量降低,盐胁迫处理时先下降后上升,9h后又下降;BnD14旱胁迫处理时在3h与12h各有两个表达高点,盐胁迫处理时在3h表达量最高.     

甘蓝型油菜G蛋白β亚基基因的克隆和表达分析

根据拟南芥等G蛋白β亚基基因的DNA序列,采用RT-PCR技术从甘蓝型油菜中克隆了一个编码G蛋白β亚基基因的全长cDNA,命名为BnAGB1.BnAGB1含有1134 bp的完整开放阅读框,编码378个氨基酸,与其它植物的Gβ亚基氨基酸序列有很高的同源性,且具有保守的Gα、Gγ结合区域及WD-40结构域.对甘蓝型油菜矮化突变体及其野生型中不同组织和不同发育时期的BnAGB1表达进行实时定量PCR分析表明:BnAGB1在矮化突变体和野生型的各个组织中均有表达;在生长旺盛期的子叶期、抽薹期和荚果期有较高的表达,而在两片真叶期、四片真叶期和花期表达较低;而且,在所有分析的不同时期和组织中,矮化突变体中的表达均显著或极显著高于野生型.以上结果表明,BnAGB1参与了甘蓝型油菜的生长发育进程的调控,与油菜矮化突变性状表现可能相关.     

青海白菜型油菜资源遗传多样性分析

为明确青海白菜型油菜资源遗传多样性,本研究以58份白菜型油菜资源为研究材料,采用AFLP标记对其遗传多样性进行分析,以期为特早熟白菜型油菜杂交育种的资源创建及亲本选配提供参考依据。结果表明:16对多态性引物共扩增出124条多态性条带,多态性比率为58.49%。遗传距离变幅在0.073～0.375,平均为0.224。在遗传相似系数0.74处,白菜型油菜资源可分为A、B两大类群,其中A类群包含4份来源于青藏高原及印度的黄籽油菜;在遗传相似系数0.76处,B类群可进一步分为4个亚类,第一、三亚类基本上为具有加拿大及欧洲遗传成分的品种(系),第二亚类只包含一个西藏品种,第四亚类大部分为青海省特早熟油菜品种。聚类分析结果显示青海省特早熟白菜型油菜资源的遗传差异较小,遗传系统独立且遗传基础单一。     

冬凌草PAL基因的克隆及表达分析

苯丙氨酸解氨酶是植物酚酸类化合物合成通路途径中的关键酶。迷迭香酸是冬凌草中的重要的酚酸类活性物质,具有抗菌消炎等药用功效。为了研究PAL基因在冬凌草酚酸类物质合成中的作用,采用RT-PCR技术克隆冬凌草PAL基因,得到序列全长1 116 bp的cDNA,最长的开放阅读框522 bp,编码173个氨基酸,相对分子质量为25.45 kD,GenBank登录号为MK304488。通过生物信息学分析,推测其为游离蛋白,三级结构的建模结果支持二级结构由19段α-螺旋组成的预测。qPCR结果显示,IrPAL基因在冬凌草叶片中表达量最多,茎次之,根中最少。该研究首次获得了IrPAL基因的全长cDNA序列,并检测在冬凌草各组织中的表达差异,为后续进一步研究IrPAL基因在冬凌草迷迭香酸合成途径中的功能奠定了基础。     

佛手GRAS基因的克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从芸香科柑橘属不耐寒植物佛手中分离得到了一个表达序列标签(EST)片段,结合RACE技术克隆获得该基因的1 669 bp序列,编码区长1 236 bp,编码413个氨基酸.通过Blastn同源序列比对分析,结果显示该基因与拟南芥已知的GRAS基因同源性较高;与GenBank数据库比对分析,表明该基因具有GRAS特有的保守结构域.因此,命名该基因为:CmsGRAS(GenBank登录号:JF440647).用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法研究了该基因在低温胁迫处理下的表达特性,结果显示该基因在低温胁迫后的表达量有明显的变化.     

黄姑鱼NK-lysin基因的克隆及表达分析

从黄姑鱼转录组数据库中筛选出NK-lysin基因,命名为YdNkl-2。YdNkl-2基因cDNA全长600 bp,其中开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸。YdNkl-2具有一个信号肽和一个鞘脂激活蛋白B（saposin B）结构域。亚细胞定位结果显示,YdNkl-2分布于细胞质和细胞核。实时荧光定量PCR结果表明,YdNkl-2的mRNA广泛分布于黄姑鱼各组织,其中在鳃和脾脏中的表达量最高。经哈维氏弧菌感染后,头肾、肝脏和脾脏中的YdNkl-2表达量均明显升高,提示YdNkl-2在哈维氏弧菌感染黄姑鱼过程中发挥重要作用。     

白菜快速碱化因子基因BcMF14的克隆及序列分析

快速碱化因子是近年来新发现的一种植物多肽类信号分子．从一个在‘矮脚黄’白菜雄性不育两用系的可育株系中特异表达的cDNA—AFLP差异片段入手,采用RACE技术克隆了该片段的基因,将其命名为BcMF14,全长581bp,不含内含子,开放阅读框长度为240bp,编码79个氨基酸．序列分析结果表明该基因与花椰菜、拟南芥等的快速碱化因子基因cDNA序列有很高的相似性,证明BcMF14属于快速碱化因子家族．     

甘蓝型油菜BnbHLH122基因的克隆、表达模式及胁迫响应分析

为了进一步探究甘蓝型油菜bHLH转录因子的生物学功能,本实验采用同源克隆技术从甘蓝型油菜中克隆了2个bHLH122转录因子基因全长cDNA序列,分别命名为:BnbHLH122-1(GenBank登录号为MT795160)和BnbHLH122-2(GenBank登录号为MT795161).生物信息学分析表明,BnbHLH122-1和BnbHLH122-2蛋白为不稳定的亲水性蛋白,都含有bHLH保守结构域,分别与白菜和甘蓝中预测的bHLH122蛋白的亲缘关系最近.亚细胞定位和转录激活活性验证实验结果表明两个BnbHLH122蛋白均定位在细胞核且具备转录激活活性.qRT-PCR实验结果表明BnbHLH122-1基因主要在花期的根中表达,BnbHLH122-2基因主要在苗期的根和花期的花中表达.此外,高温、低温、干旱、高盐、渗透、核盘菌胁迫以及ABA、SA、MeJA激素处理均能显著影响BnbHLH122基因的表达,由此说明甘蓝型油菜BnbHLH122基因可能在维持植株正常的生长发育和抵御逆境胁迫过程中发挥重要调节作用.     

应用Bulked-DNA寻找白菜型油菜细胞质雄性不育基因的RAPD标记

采用随机扩增多态DNA(RAPD)标记方法从白菜型油菜细胞质不育系与保持系的Bulked-DNA中筛选出3个与白菜型油菜细胞质雄性不育基因连锁的RAPD标记,DNA片段大小约为1300,1000和900bp.与不育基因之间的连锁距离分别为38 cm,24 cm,4 cm,LOD值为0.5,1 9,03.     

白菜型油菜原生质体培养的研究

以白菜型油菜为材料,从5日龄无菌苗的子叶和下胚轴游离原生质体,在DPD培养基中作浅层培养,密度为1×10~5个/ml。接种后48小时出现第一次分裂,6天后发生第二次分裂。此时,子叶原生质体停止发育,下胚轴原生质体可持续分裂。约一个月,形成大细胞团,转入固体培养基后可发育成愈伤组织。     

应用Bulked-DNA寻找白菜型油菜核雄性不育基因的RAPD标记

采用随机扩增多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）标记方法从白菜型油菜核不育两用系中筛选出了一个与白菜型 油菜育性基因连锁的ＲＡＰＤ标记。该ＤＮＡ片段大小约０．７２ｋｂ,与育性基因之间的遗传连锁距离为６．０８ｃＭ,ＬＯＤ值为９．１０。     

甘蓝型油菜Toc33基因启动子的克隆及序列分析

叶绿体是植物细胞中重要的细胞器,大部分叶绿体蛋白质都是由核基因组编码,在细胞质中合成分子量较大的前体蛋白,转运至叶绿体实施其功能．TOC33／TOC34是叶绿体上发现的一个外膜蛋白转运器构件蛋白,它与TOC159、TOC75和TOC64相互作用,构成了叶绿体外被膜上的一个蛋白转运器．目前已从豌豆（Pisumsa tizrurn）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、小立碗藓（Physcomitrella patens）、诸葛菜（Orychophragmus violaceus）和油菜（Brassica napus）克隆到TOC33或TOC34的cDNA或DNA的编码区．与其功能研究相比,Toc33基因的表达调控研究较少,该基因5’端调控区域的克隆及序列分析均未见报道．为此,在本实验室已经克隆到甘蓝型油菜Toc33基因编码区的基础上,采用单引物PCR方法进行染色体步移,克隆出Toc33基因的启动子,为进一步研究Toc33基因的转录调控机制奠定基础．