葫芦巴总皂苷对心肌成纤维细胞转分化的影响及机制的实验研究

目的探讨葫芦巴总皂苷(Trigonella foenum greacum.L Saponin,TFGs)对尾加压素Ⅱ(UrotensinⅡ,UⅡ)诱导体外培养的大鼠心肌间质成纤维细胞(CFs)发生肌成纤维细胞转分化的干预作用及相关分子机制.方法体外培养大鼠心肌间质成纤维细胞,随机分为正常对照组、UⅡ刺激组和TFGs干预组.正常对照组在整个培养过程中未加任何刺激;UⅡ刺激组加入10-8mol/L的尾加压素Ⅱ培养,并分别终止培养于12,24和48 h;TFGs干预组将UⅡ作为刺激因素,分别加入终浓度为0,25,50,100和200 mg/L的TFGs.应用免疫荧光和免疫组化方法检测显示α-SMA的表达,应用RT-PCR和免疫印迹法分别检测结缔组织生长因子(CTGF)的基因及蛋白表达.结果免疫荧光检测显示,培养24 h后,正常对照组细胞胞浆中仅有少量α-SMA表达,而α-SMA表达量在经UⅡ作用后明显增多.尾加压素Ⅱ干预CFs不同时间后(12,24,48 h),免疫组化显示α-SMA表达量逐渐增加.UⅡ的这种诱导CFs发生肌成纤维细胞转分化作用可被含TFGs的培养液所抑制,且呈浓度和时间依赖性.与对照组比较,UⅡ刺激组的CTGF的基因及蛋白表达均明显增高(P<0.01).而TFGs则可以抑制UⅡ诱导的CTGF基因及蛋白表达量的上调(P<0.01).结论尾加压素Ⅱ具有诱导大鼠心肌间质成纤维细胞发生肌成纤维细胞转分化的作用,此作用可能与其促进CTGF的基因及蛋白表达有关.葫芦巴总皂苷能有效地抑制大鼠CFs的转分化,并且下调UⅡ诱导的CTGF的过表达.这进一步明确UⅡ在心肌纤维化发生、发展中的作用,也为临床应用葫芦巴总皂苷防治心肌纤维化提供了实验依据.     

温阳化浊通络方对硬皮病小鼠CTGF表达的影响

本文研究温阳化浊通络方对硬皮病小鼠模型皮肤结缔组织生长因子（CTGF）、羟脯氨酸表达的影响。通过对BALB／C小鼠用博莱霉素制作硬皮病模型,分别用积雪苷片、温阳化浊通络方连续治疗4周。采用比色法、RT—PCR法和免疫印迹法分别测定皮肤组织羟脯氨酸含量、CTGFmRNA的表达及蛋白合成。实验结果与PBS组相比,模型组小鼠皮肤羟脯氨酸、CTGFmRNA及蛋白含量明显增加（均P〈0．01）,且模型组羟脯氨酸与CTGF呈直线正相关性（r=0．902,P〈0．01）。羟脯氨酸、CTGFmRNA及蛋白在温阳化浊通络方组含量均低于模型组（均P〈O．01）,且三者表达量在温阳化浊通络方组与积雪苷组问差异具有显著性（P〈0．05或P〈0．01）。结论：羟脯氨酸、CTGFmRNA及蛋白在硬皮病小鼠皮肤组织中具有较高表达;温阳化浊通络方能降低羟脯氨酸、CTGFmRNA及蛋白表达,改善皮肤硬化。     

肝包虫囊壁及周围肝组织中CTGF与TGF-β1的表达

目的:探讨CTGF与TGF-β1在形成肝包虫囊肿周围纤维囊壁中的作用及其临床意义。方法:应用免疫组化技术检测结缔组织生长因子(CTGF)与转化生长因子-β1(TGF-β1)在45例肝包虫囊肿周围纤维囊壁及周围肝组织中的表达。结果:CTGF、TGF-β1在肝包虫囊肿周围纤维囊壁中呈现特异性分层表达,CTGF、TGF-β1的阳性率在外囊中的表达率分别为55.56%、42.22%。靠近肝实质侧的外膜中CTGF、TGF-β1的阳性细胞表达率分别为80.00%、88.89%。在2层中表达的差异均有显著意义(P<0.05,P<0.05)。结论:肝包虫周围纤维性囊壁可分为内层和外层,且各自形成机制不同;CTGF、TGF-β1与肝实质侧纤维囊壁的形成有密切关系。     

TGFβ1shRNA靶向抑制离体胎鼠肺成纤维细胞TGFfβ1基因表达

目的:探讨自行设计的TGFβ1shRNA对离体胎鼠肺成纤维细胞TGFβ1基因表达的干扰作用,为研究纤维化病变的基因治疗提供技术基础和依据.方法:原代培养胎鼠肺成纤维细胞,并建立细胞高氧损伤模型.针对大鼠TGFβ1基因mRNA序列,设计、合成携带3条TGFβ1shRNA绿色荧光蛋白融合表达质粒载体,并设阴性质粒组和空白组为对照,通过JetPEI包裹分别转染上述高氧损伤的胎鼠肺成纤维细胞.转染后24、48和72 h收集细胞,在荧光显微镜下观察干扰效果,采用实时荧光定量PCR检测TGFβ1基因表达情况,并计算干扰效率.结果:①成功培养胎鼠肺成纤维细胞,并建立细胞高氧损伤模型;②荧光显微镜下观察,可见转染后24、48和72 h TG-Fβ1shRNA质粒组细胞绿色荧光强度均明显弱于阴性质粒组细胞,空质粒载体组未产生绿色荧光;荧光定量PCR检测转染后胎鼠肺成纤维细胞TGFβ1 mRNA表达量,转染后24、48和72 hTGFβ1shRNA质粒组TGFβ1 mRNA表达量均显著低于阴性质粒组(P<0.01),其基因干扰效率则依次递减,分别为97.3%、96.9%和71.7%.结论:本研究证明自行设计的TGFβ1shRNA转染胎鼠肺成纤维细胞后24、48和72 h均能够高效干扰TGFβ1基因的表达,其基因干扰效率呈现一定的时间依赖性.     

复方山楂煎剂对非酒精性脂肪肝大鼠模型的影响

目的 研究复方山楂煎剂对非酒精性脂肪肝的治疗作用及其作用机制。方法 将60只Wistar大鼠随机分 为空白对照组、模型对照组、复方山楂煎剂(低剂量14. 85 g生药/kg、中剂量29.7 g生药/kg、高剂量59.4 g生药/ kg)组,脂必妥对照组,除空白对照组外其余各组采用高脂饲料喂养大鼠8周,造模后空白对照组、模型对照组灌胃给予蒸馏水,其余各组灌胃给予相应药物,治疗6周。实验结束后,检测各组大鼠血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧 化酶(SOD)、谷丙氨酸转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)以及肝组织中的甘油三酯(TG)和肝体比,并采用HE染色 观察肝组织脂肪变性程度,采用免疫组化法检测肝组织中肝细胞生长因子(HGF)及结缔组织生长因子(CTGF)的 表达。结果 复方山楂煎剂可显著降低脂肪肝模型大鼠肝体比、血清MDA、ALT以及肝脏TG含量(P<0.05或P< 0.01)和结缔组织生长因子(CTGF)在脂肪肝模型大鼠肝组织中的表达(P<0.05)。复方山楂煎剂中剂量组、高剂量组可显著降低脂肪肝模型大鼠血清AST含量(P<0. 05或P<0. 01)、显著提高脂肪肝模型大鼠血清SOD的活性 (P<0. 05或P<0.01)和显著降低肝细胞生长因子(HGF)在脂肪肝模型大鼠肝组织中的表达(P <0.05)。复方山楂 煎剂可显著降低高脂饮食诱发的肝细胞脂肪变性程度。结论复方山楂煎剂可有效地用于非酒精性脂肪肝的治疗。     

TGF-β1在不同原因致心肌纤维化中的作用

 心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是一个复杂的病理过程,涉及多系统和多种不同机制,涉及多种细胞因子参与,其中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是重要的促纤维化因子,在病理情况下可通过经典的TGF-β1/smads 通路诱导心肌纤维化的发生发展,并最终导致心力衰竭。本文综述了高血压、糖尿病、射线损伤、病毒性心肌炎导致MF的相关机制,阐述了TGF-β1 信号通路在MF 中的作用。     

大鼠反义转化生长因子βRII/PCDNA3.1(+)真核细胞表达质粒的构建及鉴定

构建大鼠反义转化生长因子βRⅡ/PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒.查阅文献,采用两对套式引物,运用逆转录巢式PCR技术扩增TGFβRⅡ片段并经测序鉴定,双酶切纯化PCR产物及PCDNA3.1（＋）,再将TGF β RⅡ反向插入PCDNA3.1（＋）线性质粒,即构建成TGF β RⅡ/PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒.将反义质粒转染感受态细胞JM-109,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及DNA测序分析证实反义TGF β RⅡ/PCDNA3.1（＋）真核细胞表达质粒构建成功.从而为下一步抗肝纤维化基因治疗研究奠定基础.     

中国鲎黄色结缔组织的研究Ⅰ.黄色结缔组织显微结构观察

中国鲎黄色结缔组织充满整个机体内部,填充于内脏器官之间,呈浅黄色或棕褐色,为鲎体内重要的组织结构,黄色结缔组织由多种类型的细胞和丰富的细胞间质组成,构成细胞主要有营养细胞、血细胞、类巨噬细胞以及干细胞等,营养细胞是其主要的组成细胞,内含丰富的营养颗粒和脂肪颗粒,鲎的黄色结缔组织分布有大量的造血组织,前体部的黄色结缔组织中分布有数量众多的中肠盲囊。     

CTGF mRNA在糖尿病大鼠心肌中的表达及贝那普利的干预

目的研究结缔组织生长因子(CTGF)mRNA在糖尿病(DM)大鼠心肌中的表达及贝那普利(Benazepril)的干预作用.方法wistar大鼠34只建立糖尿病模型后,随机分为贝那普利治疗组及糖尿病未治疗组,12周末应用Rt-PCR检测糖尿病大鼠心肌CTGR mRNA的表达,并与正常组对照.结果DM未治疗组CTGR mRNA的表达明显高于正常组和贝那普利治疗组(P＜0.01).结论持续高糖能导致心肌CTGF mRNA表达增强,而贝那普利能在一定程度上抑制其表达,从而可能减轻糖尿病心肌病的病理变化.     

CTGF mRNA在糖尿病大鼠心肌的表达及粉防己碱保护作用的研究

目的研究粉防己碱对糖尿病(DM)大鼠心肌的保护作用及相关机制.方法36只Wistar大鼠用链脲佐菌素(STZ)诱发糖尿病模型后,随机分为粉防己碱治疗组、苯那普利治疗组及糖尿病未治疗组,以10只正常大鼠作为对照.12周末检测血糖、血脂、心肌组织血管紧张素Ⅱ,应用RT-PCR检测心肌CTGR mRNA的表达水平.结果DM未治疗组心肌组织血管紧张素Ⅱ含量、CTGR mRNA的表达明显高于对照组和治疗组(P<0.01).结论持续高糖能导致心肌血管紧张素Ⅱ含量增高、CTGF mRNA表达增强,而粉防己碱能在一定程度上降低心肌血管紧张素Ⅱ含量,抑制CTGF mRNA表达,从而可能减轻糖尿病性心肌病的病理变化.     

自体细胞来源的组织工程皮肤及其实验研究

利用患者自体来源的皮肤细胞,在经过短时间的体外培养后构建组织工程皮肤,并对其移植后的转归进行动物实验观察.分离培养头皮中的角质形成细胞及创面来源的成纤维细胞,并在体外进行传代扩增.利用三维立体培养系统构建复合细胞膜片,移植于裸鼠背部全层缺损创面,以单层细胞膜片为对照,对其转归进行大体及病理学观察.体外分离培养的皮肤细胞在体外扩增2周后即可用于构建复合细胞膜片,在移植覆盖裸鼠全层皮肤创面后,伤口愈合良好,移植2月后的病理结果显示皮肤结构明显优于单层膜片移植.证明利用患者自体来源的皮肤细胞可快速构建组织工程皮肤,有望成为治疗大面积深度烧伤患者的途径之一.     

幼鼠正畸牙移动中牙周组织内b-FGF的动态变化

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）在幼年Wistar大鼠牙周组织内的表达与分布及其在正畸牙移动中的作用。方法：建立幼年Wistar大鼠正畸牙移动的模型,在不同牵引时间段用4％中性甲醛行升主动脉灌注固定、取材、脱钙、制作石蜡标本。应用SP免疫组织化学法和图象分析仪进行半定量分析。结果：正常大鼠牙周组织中b—FGF表达较低。实验组在1d组张力侧的成牙骨质细胞b—FGF表达高于对照组,10、14d组张力侧的成纤维细胞、成骨细胞b—FGF阳性着色较正常对照组及压力侧表达有显著性差异。玻璃样变区无b—FGF表达。结论：b—FGF参与了正畸牙移动过程中牙周组织的改建。     

Molecular evolution of connective tissue growth factor in Cyprinidae （Teleostei： Cypriniformes）

Connective tissue growth factor （CTGF） plays an important role in regulation of cell growth, differentiation, apoptosis and individual development in animals. The study of sequences variation and molecular evolution of CTGF gene across various species of the cyprinid could be helpful for understanding of speciation and gene divergence in this kind of fish. In this study, 19 novel sequences of CTGF gene were obtained from the representative species of the family Cyprinidae using PCR amplification, cloning and sequencing. Phylogenetic relationships of Cyprinidae were reconstructed by neighbor-joining （NJ）, maximum parsimony （MP）, maximum likelihood （ML） and Bayesian method. Oryzias latipes from the family Cyprinodontidae was assigned to be the outgroup taxon. Leuciscini and Barbini were clustered into the monophyletic lineages, respectively, with the high nodal supports. The estimation of the ratio of non-synonymous to synonymous substitution （dN/dS） for the various branches indicated that there stood the different evolution rates between the Leuciscini and the Barbini. With the ratio of dN/dS of the Leuciscini being lower than that of the Barbini, species within the Barbini were demonstrated to be subjected to the relatively less selection pressure and under the relaxable evolution background. A 6 bp indel （insertion/deletion） was found at the 5＇ end of CTGF gene of Cyprinidae, and this 6 bp deletion only appeared in the Leuciscini, which is a typical characteristic of the Leuciscini and provides evidence for the monophylogeny of the Leuciscini. For the amino acid sequences of CTGF protein, the most variations and indels were distributed in the signal region and IGFBP region of this protein, implying that these variations were correlated with the regulation of the CTGF gene expression and protein activity.     

低阻经络研究Ⅲ. 对经络组织学本质的推断

《低阻经络研究Ⅰ》通过用4个皮肤电极的方法测量人体阻抗,发现在健康人体体表浅层存在着低电阻带：低阻经络。《低阻经络研究Ⅱ》发现在低阻经络与体表传统经络（简称经络）的位置间有着绝非偶然的一致性,从而揭示经络具有电阻率较低的客观物性。作者进一步从低阻经络的实验数据出发,依据已被普遍接受的有关生理学结论和理论,分析了导致低阻的各种可能原因,最后推断：间液（组织液）的相对含量较高是经络低阻特性的根源,而经络的组织学本质则是疏松结缔组织里的,间液的相对含量较高的带区。     

新型前交叉韧带支架材料的构建及其生物相容性的实验研究

探讨以聚羟基丁酸己酯/聚左旋乳酸(PHB/PLLA1∶1)胶原杂化支架作为前交叉韧带组织工程载体材料的可行性。制备\"三明治\"样结构PHB/PLLA共聚物并测量其孔隙率等指标。以I型胶原对制备的PHB/PLLA支架进行杂化,获得PHB/PLLA胶原杂化支架。扫描电镜观察其表面结构。将兔皮肤成纤维细胞(SF)接种于PHB/PLLA胶原杂化支架,共培养5d后,扫描电镜下观察其在材料上生长情况。PHB/PLLA支架杂化后胶原填充于纤维空隙,分布比较均匀。体外培养的皮肤成纤维细胞成功种植在支架材料上,在材料上粘附、生长良好。说明构建的支架材料具有良好的三维构型和生物相容性,有望为前交叉韧带损伤的修复提供了一种新型的支架材料。     

炎症因子在组织纤维化中介导组织型转谷氨酰胺酶的表达

本研究在肝硬化病人的标本中,发现tTG和α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,alpha-SMA)共位表达,表明tTG与肝星状细胞(hepatic stellate cells)的激活/转分化有关,与肝硬化的程度相关.烧伤病人的增生性瘢痕皮肤中tTG含量也相对于正常皮肤增加明显,并且分布于细胞外胶原蛋白之中,于alpha-SMA阳性细胞的周围.经体外星状细胞实验,白细胞介素1(interleukin 1,IL-1)能够诱导肝星状细胞在蛋白水平和mRNA水平表达tTG.同样,肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)也能诱导表皮细胞(Hacat)表达tTG.表明,在组织损伤过程中,炎症反应可能引发细胞外基质的交联,促进纤维化.     

以组织工程技术构建活性双层人工皮肤

用冷冻干燥胶原凝胶方法制备胶原海绵,经戊二醛交联处理,作为活性双层人工皮肤的支架;以幼儿包皮为细胞来源获得真皮成纤维细胞和皮肤角质细胞,体外扩增后作为种子细胞;在胶原海绵上接种成纤维细胞和角质细胞,体外构建活性双层人工皮肤。研究结果表明,人工真皮内的成纤维细胞生长良好,并且有人纤粘连蛋白类生物活性物质存在,活性双层人工皮肤表皮层有类似干天然皮肤表皮层的组织结构。