体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪

体细胞核移植转基因动物制作路线是目前生产转基因家畜的最佳方法. 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转基因猪研究可以为转基因家猪育种、人类疾病模型和人类异种器官移植研究奠定良好的基础. 本研究对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选, 以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体, 以体外成熟卵母细胞为核受体, 构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎, 并对重构胚在体外和体内发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究. 结果显示, 采用4.0 μL/mL脂质体转染试剂, 1.6 μg/mL质粒DNA, 转染6 h可以获得最佳的转染效果, 转染效率达3.61%; GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%, GFP阳性胚胎率为48%; 重构胚移植于10头受体后, 有5头妊娠, 3头受体发育到期, 共出生克隆猪6头, 其中4头为GFP阳性, 经DNA检测确认为GFP转基因猪; 转基因克隆胚胎移植出生率为1.0%, 阳性个体出生率为0.7%. 结果表明, 脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞, 获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能. 本研究对我国体细胞克隆转基因猪的研究具有重要的参考价值.     

利用鳞翅目来源的转座子piggyBac建立高效稳定的转基因家蚕技术

piggyBac转座子元件被成功应用于家蚕转基因. EGFP荧光蛋白基因作为筛选标志, 受含有Pax-6结合位点的启动子控制, 并能在家蚕的眼部组织中特异性表达. 荧光筛选质粒和piggyBac转座子表达质粒被以混合物的形式显微注射到家蚕受精卵, 获得出生的G₀代蛾子700个, 互相交配后, 利用EGFP荧光筛选获得111个独立的转基因系. 大部分转基因系在基因组上携有2个或多个插入拷贝, 并且在整个项目过程中转基因的表型稳定遗传6代以上. 对插入位点的序列鉴定发现, 其插入位点两侧具有特异性TTAA序列, 证实转基因的插入受到piggyBac转座子的调控. 高效稳定的家蚕转基因技术的建立为家蚕后基因组的研究和蚕业工业的发展提供了基础.     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离及其启动子功能分析

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

利用体细胞核移植技术生产转基因牛

通过电穿孔的方法, 将含有新霉素抗性(Neo^r)基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双标记选择载体导入胎牛输卵管上皮细胞, 获得了转基因细胞株. 以转基因细胞为核供体, 进行了牛的体细胞核移植. 重构胚胎424枚, 其中208枚体外发育至囊胚, 囊胚发育率为49.1%. 选择第7天转基因囊胚17枚移入17头同期发情的受体牛子宫角内, 共有5头受体牛妊娠, 妊娠率为29.4%. 经过正常的体内发育, 有3头转基因克隆牛出生, 产犊率为17.6%. PCR和Southern检测结果表明, 3头转基因克隆牛的基因组中都整合有外源目标基因. 并且, 绿色荧光蛋白在转基因克隆牛的耳部皮肤组织以及从耳部皮肤组织分离出的成纤维细胞中均有表达. 上述结果显示, 通过体细胞核移植技术可以有效生产转基因牛; 所构建的双标记选择载体可以有效筛选出转基因细胞和转基因克隆胚胎, 应用于转基因克隆动物的生产, 确保所培育的克隆动物均为转基因动物.     

花粉及花粉管中的膜骨架蛋白红膜肽

用免疫印迹,免疫荧光定位及免疫金标方法对百合花粉与花粉管内膜骨架蛋白红膜肽的存在和分布进行了研究。结果表明,百合花粉及花粉管内存在类红膜肽,其主要分布于高尔基体附近的囊泡膜上。     

OsCENH3-GFP融合转基因水稻的获得及其遗传应用

通过农杆菌介导的方法, 将水稻组蛋白H3与绿色荧光蛋白嵌合基因(OsCENH3-GFP)导入水稻品种中籼3037中, 经PCR及Southern blot检测, 证明该嵌合基因确已整合到水稻的基因组中. 该转基因植株发育正常, 有丝分裂及减数分裂行为均正常. 对T0及T1代转基因水稻植株有丝分裂和减数分裂过程中GFP与水稻CENH3表达关系的研究结果表明, CENH3的表达部位与GFP的表达部位完全重叠, 说明GFP与水稻CENH3已构成融合蛋白, 并且定位于染色体的着丝粒部位. 为探索该转基因植株在水稻遗传及分子生物学研究中的作用, 利用花粉母细胞减数分裂偶线期染色体, 借助水稻着丝粒串联重复序列CentO的FISH, 发现GFP信号与CentO信号完全重叠, 证明CentO序列确实为水稻不同染色体功能性着丝粒的主要成分. 利用该转基因植株, 分别制作根尖细胞有丝分裂染色体和花粉母细胞减数分裂染色体制片, 与anti-α-tublin抗体和anti-PAIR2抗体进行荧光免疫染色反应, 表明该转基因植株携带GFP标记的着丝粒, 可以与其他分子生物学手段相结合, 并能在活体细胞及组织内十分方便地显示每一染色体功能性着丝粒位置, 为深入研究着丝粒的功能提供了宝贵的遗传材料.     

川百合花粉管类血影蛋白的分离鉴定及功能分析

花粉管伸长是高等植物完成有性生殖的一个重要过程. 研究表明, 细胞骨架对花粉管的伸长有重要的调控作用, 但是目前还不清楚细胞膜骨架是否也参与花粉管伸长的过程. 血影蛋白是膜骨架的一个重要组分, 通过双向电泳和免疫印迹等方法证明, 川百合花粉管总蛋白在硝酸纤维素杂交膜上存在2个血影蛋白印迹点, 分子量分别为150和105 kD, 等电点分别为4.54和4.39. 通过提取花粉管质膜总蛋白进行SDS-PAGE和免疫印迹, 发现150 kD类血影蛋白位于花粉管的质膜上; 通过活性电泳发现105 kD类血影蛋白以210 kD形式存在于花粉管胞质中, 且很可能是以二聚体形式存在. 通过显微注射的方法将抗人红细胞血影蛋白的抗体注入正在生长的花粉管中, 花粉管的伸长明显受到抑制, 表明类血影蛋白调控川百合花粉管的伸长过程.     

花粉管通道(或运载)法转化的植株后代遗传表现及转化机理的探讨

追溯了花粉管道法的起因和形成以及现丰的应用情况,说明利用此法可以报告基因,目的基因等转入植物,经Ｓｏｕｔｈｅｎ ｂｌｔ,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ等法鉴定和对表达产物的检测,证明这是一个行之有效的转化方法。作者实验室对小麦转基因植株后代连续４代遗传表现的观察证明,转入的处源基因可以连续遗传,跗规律与其他转化方法如农干菌法,基因枪法等所得结果相似。     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

花粉中的肌动蛋白和肌球蛋白及其在花粉管伸长中的作用

植物花粉萌发后,花粉管中的细胞质流动是很活跃的。这种细胞质流动与其中的肌动蛋白和肌球蛋白有密切的关系。 花粉中存在肌动蛋白,Condeelis曾经用电子显微技术证明用孤挺花(Amaryllis belladonna)的花粉原生质体和花粉管中存在F-肌动蛋白。 我们从许多种植物的花粉中提取得到肌动蛋白和肌球蛋白,用细胞松弛素等证明花粉管中的肌动蛋白与肌球蛋白是细胞质流动的动力,并且证明花粉管的伸长受Ca~(2+)的调节。     

基于聚合物修饰的温度敏感金纳米通道阵列膜

通过在金纳米通道阵列膜上修饰聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAm)分子, 发展了一种温度敏感的纳米通道阵列膜. 以荧光素钠和水溶性量子点为探针, 考察了这种膜在不同温度下的渗透性. 结果表明, 该PNIPAm分子修饰的膜能够可逆地响应外界温度的变化, 使纳米通道的孔径大小被改变, 进而影响膜的渗透性. 当温度为25℃(<低临界溶液温度, LCST)时, 荧光探针的渗透较慢, 甚至基本上被阻止, 这是因为PNIPAm分子呈现膨胀构象使通道尺寸变小所致; 而当温度为40℃(>LCST)时, 荧光探针的渗透明显加快, 这是因为PNIPAm分子呈现紧缩构象使通道尺寸变大所致. 这种温度敏感的金纳米通道阵列膜的渗透性可以被可逆地调控, 有望用于纳米级阀门等装置.     

用基因枪将外源DNA导入中国对虾

用基因枪的方法,以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein.GFP)基因作为报告基因,和带有切割对虾白斑病病毒基因的核酶基因质粒pGDNA-RZ1导入中国对虾受精卵中,利用荧光显微镜分别对各个不同发育时期对虾幼体的处理组和对照组做了检测,绿色荧光蛋白在无节幼体和蚤状幼体中的瞬间表达强烈,对成体的RT－PCR和PCR检测表明,外源的GFP基因已转移到中国对虾体内并有相应的基因产物表达,初步建立了转基因虾的操作方法,为今后虾类基因工程育种在生产实践中的应用奠定了实验基础。     

科学发现

国内首例绿色荧光蛋白转基因猪诞生；揭开“断肠草”神秘面纱；空中玻璃走廊即将开放;“河套人”成为破解中国现代人起源之谜的关键；[编者按]     

神奇的荧光蛋白

在黑暗的深海中,常常可以看到一些通体透明而且会发光的生物。有科学家把发光水母中的绿色荧光蛋白质基因提取出来,把它转移到其他生物体内,让原本不发光的生物体也能发光。转基因荧光生物不仅是为了让人们能够拥有奇特的宠物,更是为了研究生物体的组织和细胞究竟是如何工作的,这对揭示生命的奥秘、开发环境保护新方法、研究疾病的机理和开发新药等具有重要的意义。     

转基因恐惧症

公众认识到转基因食品能够为他们带来巨大福利的那一天,转基因恐惧症就会成为新技术推广应用过程中有趣的插曲……转基因恐惧症,是一些人的现代心理病。在科学技术突飞猛进的今天,由于科学普及不到位,一些人盲目跟进,视基因和转基因为恶魔,不敢食用转基因产品,排斥转基因产品和转基因技术,出现了"转基因恐惧症"。     

日本开发转基因荧光蚕丝

日本农业生物资源研究所与群马县蚕丝技术中心等研究组日前宣布，成功培养出了世界首例可结出荧光色蚕茧的转基因蚕。随着研究的深入，掌握控制多种颜色的工业方法后，在服装业深受欢迎的丝绸就省却了染色过程，避免印染行业对环境造成的污染。     

微磁球法分离转基因烟草细胞壁CaMBP

运用亲和层析原理,并结合凝胶覆盖法,建立了一种适于小量分离纯化CaMBPs(CaM结合蛋白)的方法──微磁球法,在转基因烟草细胞壁中检测出3条可能的CaMBPs.检测结果证明分离效果较好,保留了CaMBP条带.将洗脱液收集并进行检测,发现存在可抑制被CaM激活的PDE活性的成分,而这种抑制又可被外加纯化的CaM解除,说明确实存在CaMBP. 本实验室以胡萝卜悬浮培养细胞为材料研究了外源钙调素(CaM)对植物体细胞增殖的促进作用,并用珍珠梅花粉为材料,离体萌发后观察了外源 CaM对花粉管中生殖细胞有丝分裂的影响,说明外源 CaM对植物体细胞和性细胞的增殖与分裂均有促进作用,并说明外源 CaM的作用位点可能在细胞外部;在研究光信号传递途径的工作中,暗环境中显微注射CaM,不注入单个细胞而是注射入整株植株的下胚轴中,同样激活了转基因植株中的RbcS启动子,使报告基因得到表达,说明胞外CaM介导了这一通路,为胞外存在CaMBP提供了间接证据.故此,我们进行了一系列实验以确定细胞外CaMBP的存在.     

理性面对转基因浪潮

<正>从1983年第一株转基因烟草诞生开始,转基因育种技术研究应用便拉开了帷幕。但转基因育种技术经历了整整13年时间的发展,直至1996年以转基因番茄制成的食物才第一次被允许在市场上出售。31年后的今天,转基因技术飞速发展,方法越来越娴熟,转基因品种越来越多,转入的基因也越来越广泛。有科学家甚至利用转基因技术培育出了可预防艾滋病和乙肝病     

基因枪介导质粒共转化整合模式的FISH研究

利用多色荧光原位杂交（Multi-color FISH)，在基因枪介导共转化的转基因水稻中检出了目的基因barnase-psl片段和报告基因pHcintG。在供试两单株的染色体上，这两个外源基因各有2－3个整合位点。多数情况下，barnase-psl片段与pHcintG整合在染色体的同一位置。同时，选株Q13的伸展DNA纤维荧光原位杂交（Fiber FISH)显示，两基因表现为衔接重复，重复间具有短的间隔。结合Southern杂交结果，对基因枪介导共转化可能的整合模式进行了分析。     

螺旋通道内流体流动与传热特性研究进展

螺旋通道是提高流体传热及传质效率的重要结构,以其节省空间及易于加工的特点被广泛应用.而通道内流体的流动和传热特性作为评价螺旋通道的重要性质,对其实际应用具有重要的指导意义,成为近年来的研究热点.而研究重点主要集中在螺旋通道的结构参数和流动工质两个方面,本文对螺旋通道内流体流动与传热特性研究进行综述,总结了螺旋通道结构及流动工质对其性能的影响规律;具体分析了螺旋通道直径、管径、螺距、截面形状等结构参数以及流动工质种类、浓度等物性参数对其传热系数和流动阻力的影响;对比了层流及湍流状态下实验和数值模拟结论;为螺旋通道结构优化及工质选取提供了参考,并且展望了螺旋通道内流体流动及传热特性研究的发展趋势.