p300和HDAC3介导的可逆的乙酰化作用参与调控IL-18 p1启动子荧光素酶报告基因活性

IL-18是调节先天性免疫和获得性免疫的重要细胞因子, 在Th1的发育中起着重要作用. p300是一种具有组蛋白乙酰化酶活性的转录辅因子. HDAC3是一种组蛋白去乙酰化酶. 通过一系列共转染实验证实, p300能够刺激外源IL-18 启动子活性, 而HDAC3则抑制其活性. p300的乙酰化酶活性对于增强IL-18 p1启动子荧光素酶报告基因激活是必需的. p300能提高转录因子c-Fos介导的IL-18启动子荧光素酶报告基因的活性, 这种作用能被HDAC3抑制. p300对于内源IL-18 mRNA 合成有增强作用. 首次证实了组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶参与IL-18 p1启动子活性的调控, 为进一步研究IL-18基因表达调控的机制奠定基础.     

p300和HDAC3介导的可逆的乙酰化作用参与调控IL-18pl启动子荧光素酶报告基因活性

IL-18是调节先天性免疫和获得性免疫的重要细胞因子，在Thl的发育中起着重要作用．p300是一种具有组蛋白乙酰化酶活性的转录辅因子．HDAC3是一种组蛋白去乙酰化酶．通过一系列共转染实验证实，p300能够刺激外源IL-18启动子活性、而HDAC3则抑制其活性．p300的乙酰化酶活性对于增强IL-18pl启动子荧光素酶报告基因激活是必需的．p300能提高转录因子c-Fos介导的IL-18启动子荧光素酶报告基因的活性，这种作用能被HDAC3抑制．p300对于内源IL-18mRNA合成有增强怍用．首次证实了组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶参与IL-18pl启动子活性的调控，为进一步研究IL-18基因表达调控的机制奠定基础．     

转录辅激活子p300/CBP的结构、功能及其在白细胞介素基因表达调控中的作用

p300/CBP(CREB Binding Protein，CBP)是多功能的转录辅激活子，它们参与细胞周期调控、细胞分化和细胞凋亡等多种生理过程. p300/CBP具有乙酰转移酶活性，能通过乙酰化组蛋白和非组蛋白的方式参与基因的转录调控，同时，它们能在转录因子和基本转录复合物之间起到桥梁作用，而且也能为整合多种转录辅因子提供支架. p300/CBP是肿瘤抑制子，在多种癌症中，都发现了p300/Cbp基因的突变或易位. 另外，在多种神经退行性疾病中，p300/CBP的功能受到抑制可能是引起细胞毒性的根本原因. 现已证明p300/CBP参与多种白细胞介素基因的表达调控. 结合我们的研究结果，本文对p300/CBP的结构、功能及其在白细胞介素基因表达调控中的作用进行评述.     

一个新的元件(NIRS)参与白介素2受体 a 基因的调控

为研究白细胞介素2受体a亚基(IL-2Ra)基因中与负调控元件NRE (-391/-381 bp)呈反向重复的序列NIRS (-153/-143 bp)中, 在该基因表达中的作用, 通过检测Jurkat细胞及HeLa细胞中荧光素酶报告基因活性发现, NIRS与NRE不仅共同阻遏IL-2Ra基因的组成性表达, 还共同参与介导PHA对该基因启动子的诱导活性. EMSA检测显示, 激活前后的Jurkat细胞及HeLa细胞中均含有双链NIRS和双链NRE的结合蛋白; HeLa细胞中还含有与这两个序列结合的单链结合蛋白; 但是, 激活前后的Jurkat细胞抽提物分别加入HeLa细胞抽提物与单链DNA的结合体系中均能产生超迁移现象, 其中活化细胞抽提物呈现较强的迁移结合带. 紫外交联实验检测发现, 在激活前后的Jurkat细胞和HeLa细胞中均存在双链DNA结合蛋白p83. 结果显示, 不同细胞中, 反式作用因子能通过NRE和/或NIRS元件以及单、双链DNA的选择性对IL-2Ra 基因启动子活性起关键调控作用.     

EB病毒潜伏膜蛋白1介导c-Jun/Jun B异源二聚体对p16的调节

EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1 (LMP1)是重要的致瘤蛋白, 可活化包括AP-1在内的多个转录因子. 转录因子功能性活化体现在其与靶基因启动子结合, 反式激活靶基因转录, 调节靶基因的表达, 从而发挥其生物学效应. 最近发现LMP1可介导c-Jun/Jun B活性异源二聚体的形成, 为寻找其靶基因提供了重要的依据. 采用生物信息学技术, 确定了c-Jun/Jun B活性异源二聚体调控的潜在靶基因p16; 在此基础上, 利用建立的Tet-on系统调控LMP1表达的细胞系, 采用间接免疫荧光法联合激光共聚焦荧光显微镜技术、Western blot方法、荧光素酶活性检测、Super-EMSA方法和流式细胞术, 探讨LMP1介导c-Jun/Jun B异源二聚体对p16的调节功能. 结果表明, LMP1介导的c-Jun/Jun B异源二聚体可下调p16启动子活性及其表达, 并影响细胞的演进. 该研究在AP-1信号传导通路和细胞周期之间建立了新的直接联系, 从而为肿瘤发病机制研究提供了新的思路和实验模式.     

从人到线虫的RNAa现象

RNA干扰(RNAi)原理的发现,使人们认识到小RNA-Argonaute通路介导的基因调控总是负性的,即导致基因表达沉默.2006年RNAa(RNA activation)现象的发现颠覆了这一看法,也引发争议.RNAa首先发现于人等哺乳类细胞,是由靶向基因启动子的、小RNA指导的RNAArgonaute通路对基因转录/表观遗传的正性调控.在RNAa过程中,小RNA与Argonaute蛋白形成RNA-蛋白复合物并进入胞核,与染色体上的靶位点结合,导致靶位点的组蛋白修饰等表观遗传的改变从而在转录水平激活基因表达.最近多项在线虫中的研究显示,线虫内源性22G-RNA指导Argonaute蛋白CSR-1在表观遗传水平促进内源性基因表达,以及微小RNA介导的RNAa,从而确立了RNAa是一种至少从线虫到人细胞进化保守的细胞机制,并揭示了小RNA基因调控通路的复杂性和功能多样性.     

一个新的元件(NIRS)参与白介素2受体α 基因的调控

为研究白细胞介素2受体α亚基（IL－2Rα）基因中与负调控元件NRE（－391／－381bp）呈反向重复的序列NIRS（－153／－143bp）在该基因表达中的作用，通过检测Jurkat细胞及HeLa细胞中荧光素酶报告基因活性，发现NIRS与NRE不仅共同阻遏IL－2Rα基因的组成性表达，还共同参与介导RHA对该基因启动子的诱导活性。EMSA检测显示，激活前后的Jurkat细胞及HeLa细胞中均含有双链NIRS和双链NRE的结合蛋白；HeLa细胞中还含有与这两个序列结合的单链结合蛋白；但是，激活前后的Jurkat细胞抽提物分别加入HeLa细胞抽提物与单链DNA的结合体系中均能产生超迁移现象，其中活化细胞抽提物呈现较强的迁移结合带，紫外交联实验检测发现，在激活前后的Jurkat细胞和HeLa细胞中均存在双链DNA结合蛋白p83。结果显示，不同细胞中，反式作用因子能通过NRE和／或NIRS元件以及单、双链DNA的选择性对IL－2Rα基因启动子活性起关键调控作用。     

HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子DNA的相互作用

HMG (high mobility group)蛋白质是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白, 它们在染色质的结构与功能及基因表达调控中起着重要作用. 应用凝胶电泳阻滞法和体外核小体重组技术, 分析了HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子(ε-promoter,-177 ～ + 1 bp) DNA的结合模式. 实验结果表明, HMG1/2能与ε-珠蛋白基因启动子DNA相结合, 而HMG14/17不能与它结合. 将ε-珠蛋白基因启动子DNA在体外组装成核小体后, HMG1/2则不能与组装成核小体的ε-珠蛋白基因启动子 DNA结合, 而HMG14/17却能与之结合. 结果提示, 当 ε-珠蛋白基因启动子DNA处于不同的状态时, 它所结合的HMG蛋白是不同的, 推测它们可能就是通过这种选择性的结合模式而积极参与了人体 ε-珠蛋白基因的表达调控.     

药用植物转录因子AP2/ERF研究与展望

药用植物作为中药和世界传统药物的主要来源,面临着资源稀缺和活性成分含量低等问题.通过转录水平调控发育相关基因及活性成分合成途径酶基因表达是实现定向、高效调节药用植物生长及活性成分合成的有效手段之一.因此,近年来转录因子调节药用植物发育及活性成分合成的研究备受关注.转录因子AP2/ERF家族是植物最大转录因子家族之一,家族成员均包含保守AP2结构域,根据结构域数量和识别序列不同,AP2/ERF家族被分为5个亚家族:AP2(APETALA2),ERF(ethylene-responsive factor),DREB(dehydration-responsive element binding proteins),RAV(related to ABI3/VP1)和Soloist.本文重点综述转录因子AP2/ERF调控药用植物活性成分生物合成、发育、胁迫响应的研究进展,阐述了转录因子AP2/ERF调控靶基因和自身受到调控的作用机制,同时总结转录因子AP2/ERF研究方法,提出组学和生物信息学方法成为分离、筛选转录因子,预测转录因子功能的强大工具,为分析、预测、验证药用植物AP2/ERF家族成员的功能和阐明AP2/ERF的调控机制提供理论基础和方法指导.转录因子AP2/ERF的功能研究及其作用机制的揭示将有助于利用代谢调控手段提高药用植物活性成分产量,有利于药用植物优良品种的培育,为满足人们对天然药物的需求奠定基础.     

CopG蛋白介导的DNA弯曲对σ54依赖型启动子转录起始的调控作用

以glnAp2, nifLp和glnHp2为研究对象, 在不改变上游序列增强子元件和核心启动子之间距离的前提下, 将DNA弯曲蛋白CopG的靶位点替换插入到两者之间的不同位置, 构建了一系列的同源启动子. 在大肠杆菌中, 这些同源启动子的活性被CopG介导的DNA弯曲激活或者被抑制. 不同位置的CopG靶位点, 在具有相同调控模式的同源启动子中(无论是激活还是抑制)相距为整数个螺旋, 在具有相反调控模式的同源启动子中相距为整数加半个螺旋. 我们的实验结果表明, CopG介导的DNA弯曲可能通过改变σ⁵⁴RNA聚合酶和NtrC在DNA螺旋上的相对相位关系进而可以调控σ⁵⁴依赖型启动子的转录起始.     

家蚕(苏·菊×明·虎)幼虫血清蛋白基因(BmLSP)启动子特性分析

从家蚕品种苏·菊×明·虎基因组DNA中克隆了家蚕幼虫血清蛋白基因(larval serum protein, Bombyx mori, BmLSP)的调控序列, 涵盖了第1内含子、第1外显子、启动子区和上游区. 通过PCR技术与限制性内切酶酶切方法, 以荧光素酶(luc)为报告基因, 构建了一系列缺失不同调控元件的报告质粒, 在家蚕BmN细胞瞬时表达系统中进行了BmLSP启动子的特性分析. 结果表明, 含第1内含子和家蚕丝素轻链基因同源区序列的BmLSP启动子活性分别比缺失相应序列的启动子活性提高5.8和4.4倍, 暗示该两段调控序列中含有增强启动子活性的调控元件. 上游区失活的部分水手转座子元件对BmLSP启动子活性有一定的抑制作用. 此外, 外源昆虫保幼激素类似物(JHA)呈现剂量依赖效应, 低浓度处理增强启动子活性, 高浓度处理起抑制作用; 而蜕皮激素(MH)对其活性没有显著影响.     

转录因子与肿瘤糖代谢

能量代谢重编程是肿瘤的重要特征之一.快速增殖的肿瘤细胞以高速率的糖酵解为主要的供能方式,促进肿瘤对缺氧等应激环境的适应,增加肿瘤的恶性潜能.转录因子对糖代谢基因的调控是肿瘤能量代谢重编程的重要机制之一.低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1),c-Myc,p53,NK-κB等作为调控糖代谢的主要转录因子影响糖酵解、三羧酸循环中相关基因的表达,同时糖代谢酶或产物也能反馈调节转录因子的活性.转录因子与糖代谢的相互作用关系为靶向代谢的抗癌药物的研究提供了新思路.     

转录因子与肿瘤糖代谢

能量代谢重编程是肿瘤的重要特征之一. 快速增殖的肿瘤细胞以高速率的糖酵解为主要的供能方式, 促进肿瘤对缺氧等应激环境的适应, 增加肿瘤的恶性潜能. 转录因子对糖代谢基因的调控是肿瘤能量代谢重编程的重要机制之一. 低氧诱导因子1 (hypoxia inducible factor-1, HIF-1), c-Myc, p53, NK-κB等作为调控糖代谢的主要转录因子影响糖酵解、三羧酸循环中相关基因的表达, 同时糖代谢酶或产物也能反馈调节转录因子的活性. 转录因子与糖代谢的相互作用关系为靶向代谢的抗癌药物的研究提供了新思路.     

BICP0和其环指结构域具有E3泛素连接酶活性

1型牛疱疹病毒(BHV-1)早早期(immediate early, IE)基因所编码的调控蛋白BICP0可决定病毒的感染方式, 具有多种转录调控功能. 它能促进病毒自身IE基因、早期(early, E)基因和晚期(later, L)基因以及其他一系列细胞基因的表达. 为研究其作用机理, 在E. coli中表达纯化了BICP0及其各种缺失突变蛋白. 体外活性实验表明, BICP0全长蛋白和其具有环指(ring finger)结构域的N端蛋白可以催化多聚泛肽链的形成, 具有E3泛素连接酶的功能, 暗示BICP0的转录激活功能可能通过其泛素连接酶功能实现, 为阐明BICP0在病毒感染中的作用机理提供了新视角.     

金鱼中vsx1基因抑制脊索中胚层发育调节基因ntl的表达

vsx1是最先在金鱼中发现, 在神经视网膜双极细胞的增殖、分化和正常生理功能维持中具有重要作用的转录因子基因. 在已经检测的脊椎动物物种中, 该基因都在胚胎发育的早期即开始表达, 而且其在不同物种中的时空表达模式相似, 提示该基因在胚胎发育早期可能具有重要的调节功能. 但vsx1在眼睛发育之外的发育调节功能研究尚无报道. 本研究对金鱼vsx1过表达和功能抑制对胚胎形体模式形成的影响进行了分析, 发现抑制vsx1的功能及其过表达都能严重干扰胚胎背中线脊索结构的发育. 基因表达原位杂交分析表明, vsx1过表达能显著抑制脊索中胚层发育关键调节基因ntl在背中线的表达, 而vsx1被抑制则ntl在背中线的表达范围显著扩展. 凝胶阻滞分析证明VSX1蛋白作为转录因子可与ntl启动子的特定序列直接结合. 基因表达分析证明, vsx1能有效抑制ntl启动子控制的报告基因GFP转录. 这些结果都证明, vsx1能直接抑制脊索中胚层发育关键调控基因ntl的表达, 提示vsx1在胚胎发育早期的主要功能之一可能是抑制脊索中胚层基因在神经管中异位表达, 以保障中枢神经系统按正确的模式发育.     

Ras蛋白在组蛋白乙酰化修饰介导的多头绒泡菌(Physarum polycephalum)细胞周期调控中的作用

在天然同步化的多头绒泡菌(Physarum polycephalum)细胞中, 组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A (TSA) 阻断了细胞周期S/G2, G2/M以及走出有丝分裂期的转换, 同时影响了2种ras基因(Ppras1 和Pprap1)的转录以及Ras蛋白的表达水平. 抗Ras蛋白的抗体中和实验结果表明, Ras蛋白通过调节Cyclin B1的表达水平在细胞周期转换点的调控中起重要作用. 以上结果表明, 在多头绒泡菌细胞中Ras蛋白可能是参与组蛋白乙酰化修饰介导的细胞周期调控过程的一个关键因子.     

转大豆GmDREB基因增强小麦的耐旱及耐盐性

DREB(dehydration responsive element binding)转录因子通过调控下游多个抗逆相关基因表达, 有效提高植物的抗逆性. 利用酵母单杂交技术从大豆(Glycine max)品种吉农27的cDNA表达文库中克隆了一个新的GmDREB基因. 该基因编码174个氨基酸, 具有一个由58个氨基酸组成的AP2/EREBP保守域, 其中第14与第19位保守氨基酸分别是缬氨酸(V)与谷氨酸(E), 在N末端和C末端分别有一个核定位信号区和转录激活区. 利用玉米组成型启动子Ubiquitin和拟南芥诱导型启动子rd29A构建了植物表达载体, 通过基因枪转化小麦品种鲁麦22号, 获得103株T₀代再生植株, 通过PCR检测, 分别获得含Ubi::GmDREB和rd29A::GmDREB的转基因植株13株和11株. T₁代经过PCR, Southern blot, RT-PCR检测, 证明GmDREB基因已经整合到小麦基因组中, 并在转录水平上表达. 携带Ubi::GmDREB或rd29A::GmDREB转基因株系的T₁代植株苗期耐旱或耐盐性鉴定表明, 转基因小麦植株的耐旱或耐盐能力明显提高, 说明GmDREB基因在2种不同启动子驱动下均能有效提高转基因小麦的耐盐、耐旱性.     

胚乳特异sbeⅡa启动子在小麦中的评价及特性分析

淀粉的合成是一个复杂的生化过程. sbeⅡa基因是淀粉合成过程中的关键酶基因之一, 在小麦籽粒成熟过程中对淀粉, 尤其对支链淀粉的生物合成调控起重要作用. 为了解sbeⅡa基因的调控机理及其胚乳特异表达特性, 利用APCR方法克隆了sbeⅡa启动子3094 bp片段, 并对该片段进行测序, 同时利用GUS瞬间表达体系对sbeⅡa启动子序列进行不同片段的功能缺失研究. 研究结果表明, 3094 bp序列(存在于sbe.g融合体中)具有稳定的启动子活性, 而5′或3′缺失体的启动子活性明显降低. 在sbeⅡa启动子中间缺失体中, 一些缺失体仅有微弱活性, 但sbe.e在缺失–1579~–1210 bp片段情况下, 却具有比sbe.g(含启动子全长序列)还要高的启动子活性. 研究初步证明, 一些固定序列(motifs), 如 –300 bp因子、G盒以及醇溶蛋白盒(Prolamin box)等作为正调控因子在决定启动子胚乳特异表达模式中是必需的, 而且在–1579~–1210 bp片段中也存在一些负调控因子或固定序列. 在瞬间表达检测体系中, 小麦胚乳组织年龄对检测结果有着重要影响.     

苜蓿根瘤菌1021外源cAMP上调glnⅡ及glnK-amtB的表达

苜蓿根瘤菌1021中多个腺苷酸环化酶基因的存在, 暗示着cAMP的重要性. 本研究用全基因组DNA微阵列分析了外源cAMP对苜蓿根瘤菌的功能. 分析结果表明, glnⅡ和glnK的转录水平在外源cAMP存在时有明显上调. 通过测定glnⅡ和glnK启动子与lacZYA报告基因融合系统在苜蓿根瘤菌体内的活性, 再次证实外源cAMP对glnⅡ和glnK启动子表达有激活作用.     

基于分子信标对肿瘤细胞ING1转录水平调控的定量检测

利用分子信标检测技术, 结合建立的ING1分子信标/cRNA杂交标准曲线, 定量检测了药物处理, 基因转染和p53 RNA干扰(RNAi)等对肿瘤细胞ING1 mRNA表达水平的影响. 结果发现: 在低表达ING1的肿瘤细胞系MCF-7中, 5-FU处理和ING1基因稳定转染均能诱导细胞中ING1 mRNA表达水平升高; 在ING1表达水平正常的CNE2肿瘤细胞中, 利用RNAi 沉默p53表达引起ING1 mRNA表达水平降低. 这些细胞中ING1 mRNA表达水平在7.7×10^-16~53.4×10^-16 mol/mg总RNA. 该方法不仅能从转录水平上为基因表达调控效果提供定量依据, 而且有望用于信号通路途径中多基因转录水平的相互调节研究.