蛋白激酶Ca亚类真核表达质粒的构建和过表达细胞模型的建立及初步分析

蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)是依赖于Ca~(2+)和磷脂的多功能蛋白激酶,它在细胞信号传导、生长调节、肿瘤发生中发挥重要作用.分子克隆技术表明PKC是由多基因家族编码,迄今已发现至少12种亚类,各亚类在细胞中的生理功能各有差异.为了进一步探讨特异PKC亚类在细胞生长调控中的作用,我们构建了PKCα亚类的真核表达质粒,并通过基因转染的方法导入正常人胚肺细胞(2BS),首次建立了过表达PKCα的2BS细胞模型,并对此模型进行了初步分析.     

PKCa对人胚肺细胞增值相关基因表达及AP-1活性的影响

蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）是一类丝氨酸和苏氨酸激酶,它在细胞信号传递、生长调控和肿瘤发生中具有重要作用。PKC是一个至少由12种亚类组成的多基因家族,PKC亚类的分子异质性、不同的生化性质和细胞内定位暗示其发挥不同的生理功能,为了探讨特异PKC亚类在细胞增殖、转化中的作用,我们建立了稳定过表达PKCa的人胚肺细胞模型,分析表明过表达PKCa可以促进2BS细胞的增殖速率,并能引起细胞的部分转化特征,细胞外信号一般通过细胞核内基因表达的变化最终导致细胞表型的改变,鉴于PKCa在细胞     

佛波酯可能诱导心肌细胞蛋白激酶C内源性抑制物产生

曾有文献报道卵母细胞、脑等组织中存在蛋白激酶C(PKC)内源性抑制物.心肌内是否有类似物质未见报道.培养的心肌细胞经蛋白激酶C激动剂十四酰佛波乙酸酯(PMA)处理20min,细胞浆PKC活力由对照细胞的1.60±0.8nmol/min·mg分别下降到0.83±0.45(15nmol/L PMA),0.41±0.22(100nmol/L PMA)和0.11±0.02(300nmol/L PMA)nmol/min·mg,细胞膜PKC活力由对照细胞的0.23±0.02nmol/min·mg分别升高到0.57±0.19,0.72±0.09和1.19±0.07nmol/min·mg,每组心肌细胞PKC总活力没有明显差异.结果表明PMA以浓度依赖方式激活心肌细胞PKC.纯化的大鼠脑PKC的基础活力为24.4±1.     

蛋白激酶C的抑制剂

蛋白激酶催化将三磷酸腺苷(ATP)γ位磷酰基转移到蛋白质侧链的羟基上, 从而在将胞外信号透过质膜传送到细胞质以及通过核膜传送到细胞核信号途径中起重要的作用. 蛋白激酶C(PKC)是一大类磷脂依赖的丝/苏氨酸激酶. 目前为止至少发现12个亚基, 各个亚基有不同的组织分布和功能. 由于它们与许多疾病有不同程度的关系, 如癌症、炎症、自免疫失调、心脏病等, 因此, 一些能够封闭PKC活性及阻断细胞因子与受体结合, 或干扰信号转导通路的PKC抑制剂就有可能开发成为新药. 为此人们致力于开发特异蛋白激酶特别是亚基特异性抑制剂用于疾病治疗. PKC结构有4个保守区, 针对抑制剂作用不同保守位点, 以及运用不同的抑制机理, 人们已取得了一些成绩, 有些抑制剂已进入临床实验. 本文根据抑制剂与PKC作用位点、机理, 综述近年来PKC抑制剂的发展.     

信号转导与细胞癌变

细胞内存在两类调节细胞生长的基因-生长促进基因（即原癌基因或细胞癌基因）和生长抑制基因（抗癌基因和诱导终端分化基因）,这些基因编码生长因子（或其受体）、蛋白激酶、某些酶类、鸟苷酸结合蛋白（G蛋白）、转录调节因子以及其他在信号转导中起重要作用的蛋白组分,这些基因的突变或表达异常导致其编码蛋白（癌蛋白、抗癌蛋白）数量或功能异常,引起细胞生长调控紊乱,无限生长、增殖,最终导致细胞癌变,因此,研究认号转导机制对于阐明细胞癌变的化学本质具有重要意义。     

表达反义蛋白激酶Cζ亚类的人角朊细胞模型的建立及初步分析

蛋白激酶是一种多功能蛋白激酶，至少由１２种亚类所组成，每种亚类的功能互不相同。近年的研究表明，ＰＫＣζ亚类在细胞增殖的调控中起关键作用。     

干旱、高盐及低温诱导的植物蛋白激酶基因

干旱、高盐和低温是严重影响作物生长发育及产量的3种不同形式的环境胁迫因子,它们都影响细胞的水分状态,使植物缺水遭受危害. 最近从模式植物拟南芥中克隆了一些同时受干旱、高盐及低温诱导的蛋白激酶编码基因,分别编码受体蛋白激酶、促分裂原活化蛋白激酶、核糖体蛋白激酶以及转录调控蛋白激酶. 着重介绍这些环境胁迫诱导基因的表达特性以及它们的编码产物在植物对上述环境胁迫反应和信号传递中的调控作用.     

一个猪免疫球蛋白IgG H链基因的克隆、序列分析及表达

用RT PCR方法从猪脾脏中分离到一段 1 42 5bp的DNA片段 ,该片段编码免疫球蛋白基因 .经全序列分析证明此片段与前人报道的序列有较高同源性 ,其C区属于猪Igγ链基因亚类 3.用EcoRⅠ和NsiⅠ切点将该片段切下插入pET 3b(NSEB) ( - )中 ,表达出约 5 2ku的蛋白质 ,表达量约为 2 1 % .     

去甲肾上腺素对不同初始表达水平α1B-肾上腺素受体表达的调节

选用α_1B-肾上腺素受体(α_1B-AR)密度分别为(6 336 913)和(773 164) fmol? mg^-1 的两株克隆HEK293 细胞, 分别用高表达和低表达α_1B-AR 表示, 比较去甲肾上腺素(NE)持续作用下不同初始表达水平的α_1B-AR 发生密度改变的差别. 结果显示10 mmol? L^-1 NE 持续作用48 h 可使高表达α_1B-AR 的密度发生下调, 却可使低表达α_1B-AR 的密度发生上调. 蛋白激酶C(PKC)抑制剂RO- 31-8220 或Calphostin C 可消除NE 对高表达α_1B-AR 的下调作用, 但对低表达α_1B-AR 的密度上调无影响. PKC 激动剂PMA 不仅可模拟NE 对高表达α_1B-AR 的下调作用, 而且使低表达α_1B-AR 的密度也发生下调. 肌浆网/内质网钙泵抑制剂CPA 和内钙螯合剂BAPTA-AM 不影响NE 对高表达α_1B-AR 的下调作用, 但可部分抑制低表达α_1B-AR 的上调. 以上结果提示, NE 持续作用可对初始表达水平不同的α_1B-AR 密度产生不同方向的调节作用, 作用机制亦不尽相同.     

CB促微丝解聚对cAMP-PKA信号通路的作用

细胞内第二信使双酰甘油(DG)和环腺苷酸(cAMP),在对外界信号的应答反应中起重要作用.DG激活蛋白激酶 C(PKC),cAMP激活蛋白激酶A(PKA),引起一系列靶蛋白磷酸化级联反应,调节细胞的增殖、分化和其它生理功能.我们曾发现,细胞松弛素B(CB)不仅改变微丝(MF)组装,并能刺激DG-PKC信号通路.有文献报道,在 G_0至S期早期,cAMP-PKA信号通路的激活对肝细胞的增殖具有促进作用,而这两种信号通路可能通过PKC的作用加以偶联,即PKC可通过磷酸化Gi蛋白激活cAMP-PKA信号通路.MF组装     

吩噻嗪类衍生物对蛋白激酶C及肿瘤细胞多药耐药的作用

应用MTT法研究了几个吩噻嗪类衍生物 (PTZ6,PTZ7及PTZ11)对多药耐药的逆转作用 ,同时检测了PTZ对PKC活性的抑制作用 .结果表明 ,PTZ6,PTZ7及PTZ11在K562 /AO2细胞中对阿霉素耐药作用的逆转倍数分别为 2 .4 9,3 6.58和 75.78倍 ,表明PTZ11具有较高的逆转MDR的活性 ;在PTZ存在时 ,PKC的活性分析表明 ,PTZ6及PTZ11以剂量依赖性方式抑制PKC活性 ,其IC5 0 值分别为 (4 89.77± 3 1.4 )和 (113 .0 0± 9.64 ) μmol/L ,而PTZ7对PKC活性无抑制作用 ;在PMA存在时 ,PTZ11对PKC的抑制作用减弱 ,表明PTZ11可能与PMA竞争PKC的结合部位 .为阐明PTZ抑制PKC活性的分子机制 ,进一步应用计算机软件系统模拟PTZ6和PTZ11与PKC结合的分子图象 ,发现PMA通过氢键与PKC结合 ,而PTZ6及PTZ11通过疏水力及静电作用与PKC结合 ,且PTZ11与PKC结合的疏水力大于PTZ6,从而在三维分子构象水平阐明了PTZ抑制PKC活性的机制 ,并为设计新的PKC抑制剂或多药耐药逆转剂提供了崭新的资料     

小鼠趋化性细胞因子MIP-2对胸腺细胞亚群的趋化作用分析

经RT－PCR证实,趋化性细胞因子MIP－2（巨噬细胞炎症蛋白2）不仅表达于小鼠腹腔巨噬细胞,亦表达于新鲜培养的小鼠胸腺基质细胞,且小鼠DN,DP,CD4SP和CD8SP4个胸腺细胞亚群也不同程度表达其特异受体CXCR2。通过Boyden小室趋化实验证实,重组小鼠MIP－2对胸腺细胞4个主要亚群有不同强度的趋化作用,主要趋化DP和SP胸腺细胞亚群,从而报道了MIP－2参与诱导胸腺细胞发育过程中的定向迁移。     

吩噻嗪类衍生物对蛋白激酶C及肿瘤细胞多药耐药的作用

应用MTT法研究了几个吩噻嗪类衍生物 (PTZ6,PTZ7及PTZ11)对多药耐药的逆转作用 ,同时检测了PTZ对PKC活性的抑制作用 .结果表明 ,PTZ6,PTZ7及PTZ11在K562 /AO2细胞中对阿霉素耐药作用的逆转倍数分别为 2 .4 9,3 6.58和 75.78倍 ,表明PTZ11具有较高的逆转MDR的活性 ;在PTZ存在时 ,PKC的活性分析表明 ,PTZ6及PTZ11以剂量依赖性方式抑制PKC活性 ,其IC₅₀ 值分别为 (4 89.77± 3 1.4 )和 (113 .0 0± 9.64 ) μmol/L ,而PTZ7对PKC活性无抑制作用 ;在PMA存在时 ,PTZ11对PKC的抑制作用减弱 ,表明PTZ11可能与PMA竞争PKC的结合部位 .为阐明PTZ抑制PKC活性的分子机制 ,进一步应用计算机软件系统模拟PTZ6和PTZ11与PKC结合的分子图象 ,发现PMA通过氢键与PKC结合 ,而PTZ6及PTZ11通过疏水力及静电作用与PKC结合 ,且PTZ11与PKC结合的疏水力大于PTZ6,从而在三维分子构象水平阐明了PTZ抑制PKC活性的机制 ,并为设计新的PKC抑制剂或多药耐药逆转剂提供了崭新的资料     

植物细胞质中存在类Fas死亡因子的实验证据

动物细胞中Fas的主要功能是激活胞质中的死亡程序。在长日条件下生长的G2豌豆生长锥细胞胞质中， 液泡在诱导细胞死亡的过程中起着关键作用。G2豌豆中Fas的表达模式表明，类Fas主要存在于程序化死亡细胞的泡中。烟草原生质体中Fas的表达与维生素K诱导的程序化细胞死亡的启动密切相关。该研究表明，植物细胞中可能存在着类Fas介导的胞质细胞死亡途径。     

芹菜素通过抑制PKB/Akt激酶活性诱导人胃癌细胞凋亡

芹菜素是一种广泛分布于水果和蔬菜中的黄酮类物质. 研究证实, 芹菜素在体外可以抑制多种肿瘤细胞的生长, 但其发挥抗肿瘤作用的确切机制目前还不十分清楚. 采用人胃癌细胞株为肿瘤模型, 在体外探讨了芹菜素对胃癌细胞的生长抑制和凋亡诱导作用. 结果发现, 芹菜素可以明显抑制胃癌细胞的生长. 此外, 利用DNA琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA梯形条带, Western blotting方法检测到Caspase-3的活性片段, 并呈现明显的时间依赖关系, 说明芹菜素可以诱导细胞发生凋亡. 进一步研究发现, 芹菜素在诱导细胞凋亡的同时可以抑制蛋白激酶B (Akt)的激酶活性. 芹菜素可以时间依赖方式抑制与细胞增殖相关的Akt及Akt下游促凋亡蛋白Bad的磷酸化, 但对总Akt及总Bad蛋白的表达无影响. 实验结果提示, 芹菜素可以通过抑制Akt激酶活性而诱导胃癌细胞发生凋亡. 由于已经证实在多种肿瘤细胞中存在Akt激酶的活化, 因此对肿瘤细胞中Akt激酶的抑制将为肿瘤的临床治疗提供新的思路.     

雀之屏

<正>作品简介：大脑类器官具有和胚胎脑组织类似的蛋白表达,是人类神经疾病研究的新型模型。图中的大脑类器官是利用人的胚胎干细胞体外分化40天得到,由Olympus FV3000激光共聚焦显微镜拍摄。作品展示了大脑类器官中神经祖细胞丰富的管状区域,绿色为神经细胞结构蛋白tubulin βIII,红色为DNA损伤蛋白γH2AX,蓝色为DAPI染色的细胞核。     

v-fos转化效应因子是CD2胞内区新的结合蛋白

在以前的研究中, 本实验室采用酵母双杂交技术, 从人KT3 T淋巴细胞cDNA文库中筛选到一个与CD2胞内区结合的新的蛋白分子, 称为v-fos转化效因子(v-fos transformation effector, Fte-1). 本研究进一步分析鉴定了Fte-1与CD2相互作用的分子机制和Fte-1的生物学功能. 应用研究生物大分子相互作用的生物传感器分析了CD2胞内区与Fte-1结合特性和亲和力, 表明二者确为特异性结合, 其解离常数K_D值为10^-7 mol/L; 分子缺失突变和体外磷酸化实验结果表明, Fte-1可被蛋白激酶C(PKC)磷酸化, 其磷酸化位点为Ser238; 基因表达研究显示, 在Jurkat T淋巴细胞白血病细胞中Fte-1呈簇集性分布; CD2单克隆抗体T11刺激Jurkat T淋巴细胞后, Fte-1这种簇集性分布特征消失, 而趋向细胞膜, 并与 CD2共定位于细胞膜区域; Fte-1的PKC磷酸化位点Ser238突变为Gly238后, 其与CD2分子的共定位能力丧失, 表明Fte-1的Ser238的PKC磷酸化对Fte-1和CD2在T淋巴细胞内的结合起关键作用; 使用Fte-1干扰RNA技术抑制Fte-1在Jurkat T淋巴细胞中的表达, 可抑制佛波酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)引起的Jurkat T淋巴细胞激活后凋亡, 提示Fte-1参与了CD2对T淋巴细胞凋亡的调节. 上述结果进一步确证Fte-1是CD2胞内区的特异结合蛋白, 并可能参与了CD2介导的细胞凋亡信号传递.     

表达钙调素反义RNA人肝癌细胞模型的建立及其对细胞增殖和转化的作用

作为Ca~(2+)在细胞内的主要受体,钙调素(Calmodulin,CaM)广泛存在于各种真核细胞中,是一种能调节细胞生长、分化和转化的多功能蛋白。 由于CaM的反义RNA相对于它的多种拮抗剂来说具有更强的特异性并且没有药理毒性作用,因此我们构建了表达钙调素反义RNA的人肝癌细胞模型,并对此模型在钙调素低表达状态下的生长特性、周期分布、基因表达及其与转化的关系进行了分析,以探讨钙调素对细胞增殖与转化的影响。     

VEGF在小鼠膀胱癌肿瘤生长与转移中的作用

探讨VEGF在膀胱肿瘤生长和转移中的作用, 实验结果表明, 反义VEGF₁₂₁表达质粒转染能够明显降低肿瘤细胞产生VEGF. 稳定转染的克隆其VEGF的表达量仅为未转染的亲代细胞的12%及19%. 低水平表达VEGF的肿瘤细胞在体外的生长速度与未转染的亲代细胞间无明显差异, 但在同系小鼠体内的致瘤能力、生长速度及肺、肝等实质器官的转移率等均明显低于亲代细胞. 进一步比较高水平与低水平表达VEGF的肿瘤细胞对体外培养的小鼠血管内皮细胞生长的影响、体内肿瘤组织中微血管数目及通透性等, 证实膀胱癌细胞产生VEGF的能力与其诱导肿瘤新生血管形成的能力一致, 在肿瘤生长与转移过程中起重要作用.     

CⅡTA反义RNA对HLAⅡ类分子表达的仰制作用

为研究ＭＨＣⅡ类基因转录活化因子（ＣⅡＴＡ）对人类白细胞抗原（ＨＬＡ）Ⅱ类分子表达的影响,用ＲＴ－ＰＣＲ方法从Ｒａｊｉ细胞中克隆到Ｃ Ⅱ ＴＡ基因ｃＤＮＡ ５＇端片段,构建成ＣⅡＴＡ反义ＲＮＡ真核表达载体 ｐｃＤＮＡ－Ⅱ,基因转移 ＨＬＡ Ⅱ类分子诱导型表达的 ＨｅＬａ细胞．经 ＩＦＮ－γ诱导,发现稳定转染ｐｃＤＮＡ－Ⅱ的细胞中ＨＬＡ－ＤＲ,ＤＰ和ＤＱ的表达均较转ｐｃＤＮＡ３空载体的细胞有显著下降,而 ＨＬＡⅠ类分子的表达不受影响．实验证明 ＣⅡ ＴＡ反义 ＲＮＡ对 ＨＬＡ Ⅱ类分子表达具有显著的抑制作用,为进一步开展低免疫原性的细胞移植提供了依据．