渗透胁迫调节拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶3的基因表达

以拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶3 (ATGPX3)的T-DNA插入突变体和转ATGPX3启动子GUS融合基因植株为材料, 深入分析了ATGPX3基因表达及其在渗透胁迫信号转导中的作用. 甘露醇渗透处理后, 与野生型拟南芥相比, ATGPX3基因突变体(atgpx3-1)的生长和发育明显受到了抑制; 并且渗透胁迫也提高了ATGPX3-GUS融合基因的表达. 在植物激素ABA诱导下, RD29A, ABI1, ABI2和RbohD等基因在atgpx3-1突变体中出现了不同程度的表达. 以上结果提示, ATGPX3可能参与了渗透胁迫反应的调节.     

拟南芥SRO1调节植物重金属汞胁迫应答

环境中重金属过量会限制植物的正常生长发育.本研究分离鉴定了一个拟南芥T-DNA插入突变体,其幼苗表现出对HgCl2高度敏感.分子遗传学分析发现该突变表型是SRO1基因突变所致;蛋白序列分析展示SRO1含有介导蛋白与蛋白互作的WWE结构域.进一步研究表明,sro1-1植株在HgCl2处理下,生长受到严重抑制,突变株表现出黄化、真叶减少等生长缺陷特征.电导率检测表明,突变体的细胞膜破坏比野生型更严重.利用DAB染色和激光共聚焦显微镜成像技术研究证明,突变体在重金属胁迫下积累更多的H2O2.定量RT-PCR证实在氧化和重金属胁迫下,sro1-1中一些与非生物胁迫相关的基因如APX1的表达明显受到抑制.GFP::SRO1转基因植物证明SRO1蛋白定位于细胞核中.另外,SRO1基因在植物多种组织中均有表达,且生长比较旺盛的组织表达水平更高.以上结果表明,SRO1基因在拟南芥响应重金属汞胁迫中发挥重要作用.     

光敏色素影响赤霉素调控的水稻幼苗光形态建成特征

赤霉素(gibberellin, GA)是一种重要的植物激素, 它与光敏色素协同调节拟南芥植株的光形态建成特征. 但是GA对水稻幼苗光形态建成和暗形态建成的影响, 特别是在此过程中光敏色素与GA之间的相互作用仍不清楚. 本研究利用野生型和光敏色素突变体(phyA和phyB)水稻作为研究材料, 分析了GA生物合成抑制剂多效唑(PAC)对黑暗和光照下生长的水稻幼苗胚芽鞘、地上部分和主根延伸以及光调控基因LHCB表达的影响. 据此推测, 在暗生长条件下, PAC处理能够抑制野生型水稻幼苗胚芽鞘的生长, 诱导LHCB基因的表达; phyA突变体对PAC处理的反应不如野生型敏感; phyB突变体和野生型反应基本相同. 在光照条件下, PAC处理能够抑制水稻幼苗地上部分的生长, phyB突变体对PAC处理的反应不如野生型和phyA突变体敏感. 此外, phyB介导的光信号负调控PAC诱导的主根延伸反应. 据此推测, GA是维持水稻幼苗暗形态建成、抑制光形态建成所必需的; 另一方面, phyA和phyB或正或负调控PAC所诱导的光形态建成反应. 本研究结果揭示了光敏色素和GA在水稻幼苗生长发育中的相互作用, 为进一步研究光和GA协同调控水稻发育的分子机制奠定了基础.     

液泡定位的β-葡萄糖苷酶增强拟南芥的耐旱性

植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)在植物生长发育及适应多种胁迫环境过程中发挥重要作用, 植物在应对这些不断变化的生理需求及环境条件时细胞内ABA 水平也发生相应的变化. 迄今为止, 人们还未完全了解植物体内ABA 水平的精细调控机制. 本文中, 我们的研究表明拟南芥中β-葡萄糖苷酶家族成员之一BGLU10 参与了植物的耐旱性反应. T-DNA 插入纯合突变体bglu10 表现出干旱敏感的表型, 包括快速的水分丧失, 叶片表面温度较野生型低,ABA 含量、β-葡萄糖苷酶活性及ABA 和干旱响应基因的表达量均低于野生型. 与bglu10 突变体相比, BGLU10 的超表达转基因植物比野生型耐旱性更强, 表现为较低的失水速率, 较野生型更高的ABA 含量、β-葡萄糖苷酶活性及ABA 和干旱响应基因的表达水平. 拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达结果证明BGLU10 蛋白定位于液泡中. 另外, BGLU10 基因在植物多种组织中均有表达, 且受多种非生物胁迫诱导表达, 这些结果暗示了BGLU10 可能在多种胁迫条件下水解ABA-葡萄糖苷(ABA-GE)释放自由ABA, 参与植物对这些胁迫的应答反应.     

一个编码含VQ 模序蛋白的基因AtARVQ1 参与拟南芥对砷酸盐的响应调控

砷酸盐(As^Ⅴ)是一种对包括人类和植物在内大部分生物具有剧毒的重金属. 结果显示, 编码含植物特有VQ 模序蛋白基因AtARVQ1 (arsenate-repressed VQ motif-containing protein 1)参与拟南芥对As^Ⅴ应答和抗性调控. 结果表明, 砷酸盐胁迫强烈抑制AtARVQ1 基因在拟南芥中的转录表达.进一步利用组成型启动子CaMV 35S 驱动AtARVQ1 基因在拟南芥中的表达, 获得在砷酸盐处理条件下增强AtARVQ1 基因转录的超表达植株, 发现超表达AtARVQ1 可以明显提高拟南芥对砷酸盐的抗性水平. 系统进化分析发现, 含VQ 模序结构的AtARVQ1 同源基因为植物特有, 并进化出两大分支4 个子分支, 这类同源基因在双子叶植物和苔藓中分布于两大分支上, 而在单子叶植物中仅分布在同一子分支上. 这些结果表明, AtARVQ1 基因在拟南芥对砷酸盐的抗性应答上有着重要作用, 而其同源基因也可能在其他植物对砷胁迫应答中发挥作用.     

异源表达一个大豆Na+/H+逆向转运蛋白基因GmNHX2提高拟南芥的耐盐性

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白调节细胞内的离子内平衡, 在植物耐盐性起重要的作用. 本研究克隆一个大豆Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的同源基因GmNHX2, 编码一条长534氨基酸的多肽并预测有10个可能的跨膜结构域. GmNHX2在大豆的根、茎和叶中表达, 但在根中的丰度最高, 受NaCl和PEG (polyethylene glycol)处理的诱导表达. GmNHX2与LeNHX2和AtNHX2的序列相似性高于AtNHX1和AtSOS1. 尽管系统发育分析将GmNHX2与细胞器(液泡和囊泡)逆向转运蛋白聚成一类, 但亚细胞定位的结果表明GmNHX2-EGFP (enhanced green flurescent protein)融合蛋白可能位于植物细胞的质膜或细胞器膜上. 与野生型植株相比, 异源表达GmNHX2的拟南芥植株在萌发和幼苗期都更加耐高浓度的NaCl. 这些结果暗示, GmNHX2是一个Na+/H+逆向转运蛋白同源物, 可能在盐胁迫下执行调节离子内平衡的功能.     

多种胁迫下拟南芥气孔“开”和“闭”突变体鉴定及遗传初步分析

保卫细胞可以整合和处理多种复杂的环境信号刺激, 从而使气孔处在合适的开闭状态以适应外界环境的变化. 但是保卫细胞对多种刺激反应过程中许多中间成分及其信号转导的细节知之甚少. 利用远红外成像仪, 建立起气孔反应的筛选体系, 在不伤害植物的前提下, 对经化学诱变的拟南芥幼苗进行多种胁迫信号(干旱、H₂O₂及CO₂等)单独或复合处理, 以幼苗叶片温度高于或低于正常植株0.5℃以上为筛选指标, 通过对大约6万株诱变后的拟南芥M2代幼苗进行筛选, 得到了40多株拟南芥气孔突变体. 经过对这些突变体后代进行生理和杂交遗传分析, 发现所得突变体为隐性单基因突变所致, 并且突变体对气孔关闭的调节上都与野生型有明显的差异. 这些突变体的获得为探索保卫细胞内复杂的信号转导网络提供了良好的遗传材料.     

ATHK1位于过氧化氢下游并通过调节钙通道介导保卫细胞ABA信号转导

植物通过不断进化增强对环境中水分缺乏的抵抗能力.脱落酸在植物干旱和渗透胁迫反应中起到重要的作用.组氨酸激酶也被认为是作为感受子和调节子对水分亏缺作出反应.本研究结果显示,组氨酸激酶1介入了拟南芥脱落酸诱导的气孔信号转导,该酶此前被认为是一种渗透调节因子.ATHK1基因缺失突变体不能表现保卫细胞中正常的脱落酸反应,包括气孔关闭、过氧化氢产生以及钙内流.膜片钳及激光共聚焦结果显示,ATHK1在脱落酸诱导的气孔关闭过程中可能位于过氧化氢下游,并通过调节钙通道和保卫细胞钙震荡来起作用.     

通过转δ-OAT基因获得抗盐抗旱水稻

δ-OAT基因编码的鸟氨酸-δ-氨基转移酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径中的关键酶.采用基因枪法将拟南芥δ-OAT基因导入粳稻品种中作321,通过PCR及分子杂交分析确定目的基因已插入水稻染色体中并得到超量表达.抗盐抗旱检测结果表明,水稻在受到渗透胁迫时会大量积累脯氨酸,各种条件下转基因水稻积累的脯氨酸是对照的5～15倍;同等胁迫条件下转基因株系相对生长更快,苗与根的生物学产量都要高于对照,最后种子产量也显著高于对照,如在0.1 mol/LNaCl胁迫下转基因株系相对产量提高了16%～41%,说明δ-OAT基因超量表达并积累脯氨酸在抗渗透胁迫中有着重要作用,通过转化δ-OAT基因可以获得抗盐抗旱的基因工程水稻.     

通过转δ-OAT基因获得抗盐抗旱水稻

δ-OAT基因编码的鸟氨酸-δ-氨基转移酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径中的关键酶. 采用基因枪法将拟南芥δ-OAT基因导入粳稻品种中作321, 通过PCR及分子杂交分析确定目的基因已插入水稻染色体中并得到超量表达. 抗盐抗旱检测结果表明, 水稻在受到渗透胁迫时会大量积累脯氨酸, 各种条件下转基因水稻积累的脯氨酸是对照的5~15倍; 同等胁迫条件下转基因株系相对生长更快, 苗与根的生物学产量都要高于对照, 最后种子产量也显著高于对照, 如在0.1 mol/L NaCl胁迫下转基因株系相对产量提高了16%~41%, 说明δ-OAT基因超量表达并积累脯氨酸在抗渗透胁迫中有着重要作用, 通过转化δ-OAT基因可以获得抗盐抗旱的基因工程水稻.     

过氧化氢参与了脱落酸调控的拟南芥根形态发育

脱落酸（abscisic acid，ABA）可以抑制拟南芥根的伸长生长和促进根尖根毛的发育，但其中的信号转导机制仍还不清楚。本研究利用拟南芥野生型和突变体为实验材料，发现过氧化氢（hydrogen peroxide，H₂O₂）对野生型根生长的影响与ABA类似；而抗坏血酸(ascorbic acid，Vc)可逆转ABA对野生型根生长的效应；在拟南芥NADPH氧化酶缺失突变体atrbohF和atrbohC中ABA的这种作用丧失。激光共聚焦和实时定量RT-PCR分析表明ABA可以诱导拟南芥根细胞H₂O₂的产生，并可增强H₂O₂相关基因OXI1的表达。我们的结果初步表明H₂O₂作为一种重要的信号分子参与了ABA调节根生长发育的信号转导过程。     

光敏色素B介导光信号影响水稻的脱落酸途径

研究表明,拟南芥中光敏色素介导的光信号与植物激素脱落酸(abscisic acid,ABA)途径相互作用.但水稻光敏色素与ABA途径之间是否相互影响仍不清楚.利用野生型和phyB突变体水稻作为研究材料,分析phyB介导的光信号对ABA生物代谢和ABA反应的影响.结果表明,ABA合成代谢相关基因OsNCED1,OsNCED2,OsNCED3和OsNCED4在phyB突变体中的表达水平明显高于野生型,而ABA降解代谢基因OsABAOX1则相反,这可能解释了phyB突变体积累较多内源ABA的原因.外源ABA处理明显抑制黑暗和光照下生长的水稻种子的萌发,但光照条件下ABA对phyB突变体种子萌发的抑制效果更明显.据此推测,phyB感受的光信号消弱了ABA对种子萌发的抑制效果.通过分析部分已报道的种子萌发相关基因在正常或ABA处理的野生型和phyB突变体中的表达水平,结果表明,phyB介导的光信号对水稻种子萌发的调控作用可能与这些基因无关.此外,在红光条件下,ABA处理能够抑制水稻幼苗地上部分的生长,野生型和phyB突变体对ABA处理的反应基本相同;但是ABA对phyB突变体主根生长的抑制效果显著高于野生型,这个结果表明phyB介导的光信号不影响ABA对水稻幼苗地上部分生长的抑制效果,但负调控ABA对主根生长的抑制效果.上述研究结果表明,phyB介导的光信号负调控水稻ABA的积累和ABA反应.本研究揭示了水稻光敏色素对ABA途径的影响,为深入研究光信号途径和ABA途径之间协同调控水稻发育的分子机制奠定了基础.     

拟南芥液泡膜水孔蛋白的互作蛋白AtSM34 参与种子萌发的渗透胁迫响应

水孔蛋白(aquaporin, AQP)广泛参与植物的各种生理活动, 但还有许多调控机制未被发现. 为进一步对其调控因子进行研究, 运用酵母双杂交筛选拟南芥液泡膜水孔蛋白TIP1;1(tonoplast intrinsic protein, TIP)的互作子, 这是拟南芥中第一个被发现的液泡膜上具有高度水转运活性的蛋白. 以AtTIP1;1 为诱饵, 筛选得到一个新的TIPs 结合蛋白, 并在酵母和植物细胞中验证了这种结合. 该蛋白被命名为AtSM34, 编码一个含309 个氨基酸的多肽, 预测分子量为34 kD, 具有1 个单独的MYB/SANT 样结构域. AtSM34 启动子融合GUS 组织化学染色分析显示, 其表达主要位于花、茎和叶中, 尤其是维管束组织, 并且响应渗透胁迫. AtSM34 定位于内质网, 截断分析显示其N 端(1~83 位氨基酸)对于其定位至关重要. 过表达AtSM34 导致转基因植物对外源甘露醇、山梨醇及脱落酸更加敏感, 表现为萌发延迟. 进一步研究发现,AtSM34 也可与AtTIP1;2 和AtTIP2;1 结合, 这2 个TIP 蛋白对液泡渗透调节发挥着重要作用,并在种子萌发阶段大量表达. 这暗示着AtSM34 可能通过影响水孔蛋白基因的表达, 参与种子萌发早期阶段的渗透胁迫响应.     

基因转录后沉默信号可以在拟南芥嫁接体内快速双向传递

RNA干扰(RNAi)是引起生物体基因转录后沉默的新技术之一, 通过转基因向植物体内引入特异的RNA沉默信号, 已成功用于基因功能研究. 我们利用拟南芥动蛋白异型体KatB和KatC两个基因上共有的一段同源编码序列(168 bp)构建了能导致目标基因KatB和KatC双基因转录后沉默的DEX (dexamethazone) 诱导性RNAi载体. RT-PCR和Northern blot结果显示, 转基因拟南芥纯合体植株(简称RNAi型植株)经DEX诱导后,KatB和KatC的mRNA逐渐减少, 表明这两个基因发生了转录后沉默作用. 用改进后的简易方法将RNAi型与野生型拟南芥植株进行高效率嫁接, 对砧木和接穗中目标基因mRNA变化进行了半定量RT-PCR检测. 结果表明, 无论用RNAi型植株作为砧木或接穗, DEX诱导产生的基因沉默信号均能导致相应野生型接穗或砧木中KatB和KatC mRNA的减少, 证明说明基因转录后沉默信号可以通过嫁接面在拟南芥体内双向传递; 与已报道的基因沉默信号在烟草嫁接体内传递速度相比, 拟南芥基因沉默信号的传递更为迅速．     

小麦抗盐突变体根液泡膜微囊H+转运活力在NaCl胁迫下增强

从经过盐胁迫的小麦抗盐突变体和野生型幼苗根部分离的液泡膜微囊,其依赖于ＡＴＰ和ＰＰｉ的Ｈ＾＋转运活力均有明显的增加,突变体的转运活力显著高于野生型。Ｈ＾＋转运活力以达到稳态时每毫克膜蛋白的荧光猝灭值表示。依赖于ＡＴＰ的转运活力,突变体和野生型分别为１０９９和５５８;依赖于ＰＰｉ的转运活力,突变体和野生型分别为３５８和２２８。     

转OsNHX1基因耐盐84K杨的培育

采用农杆菌介导的方法将水稻Na+/H+反向转运器基因OsNHX1导入84K杨, 获得3株抗性转化植株, PCR, Southern 和Northern检测结果表明, OsNHX1基因已经整合到84K杨基因组中, 并可以稳定表达. 耐盐实验表明, 3个株系的转基因植株能在200 mmol/L NaCl条件下正常生长. 对盐胁迫处理的转基因植株进行Na+含量和渗透势测定, 发现转基因植株叶片中的Na+明显高于对照植株, 其渗透势明显低于对照植株. 分子检测和耐盐性实验表明OsNHX1基因的转化获得成功, 并获得84K杨耐盐转基因 植株.     

拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶AtPLC6基因的克隆与表达

利用文库筛选和RT-PCR方法, 从拟南芥中克隆到长度为1954 bp, 包括全长1734 bp编码区的AtPLC6 cDNA, 推测其编码一含有578个氨基酸的多肽, 其等电点为7.24, 分子量为66251.84 Da. 在GenBank中进行序列比对发现, AtPLC6为一新发现的拟南芥PI-PLC基因. 对推测的氨基酸序列结构的分析表明, AtPLC6具有EF手性结构、X结构域、Y结构域和C2结构域, 与植物中已知的其他磷酸肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)在结构上相似, 类似于动物中典型的δ-型磷酸肌醇特异性磷脂酶. 将AtPLC6的编码区序列插入原核表达载体后进行了原核表达, 纯化的AtPLC6重组蛋白可水解PIP2产生IP3和DAG, 且水解活性呈明显的钙依赖特性, 反应的最适Ca²⁺浓度为10 μmol/L. Northern分析结果表明, 在检测的根、茎、叶、花、果和幼苗中均有AtPLC6 mRNA的转录, 但转录水平较低. 用ABA, NaCl, 冷和热等胁迫处理的实验表明, AtPLC6 mRNA的转录受到冷胁迫的诱导, 而受ABA, NaCl和热等胁迫影响较小, 推测AtPLC6可能参与了植株对冷胁迫的响应.     

一个水稻铁转运基因(OsFRDL1)参与缺氧诱导根系铁膜形成的调节过程

根表铁膜是水稻重要的养分库和抵抗环境胁迫的天然屏障.然而根表铁膜形成的分子机制并不清楚.本文以日本晴野生型对照及Osfrdl1突变体为材料,研究了OsFRDL1基因在水稻根表铁膜形成中的作用.结果发现,低磷(0.02 mmol L-1)是水稻根表铁膜形成的重要条件.当处理溶液pH为5.0~6.0,FeSO4浓度为30~50μmol L-1时,根表铁膜含量最大.与通气处理相比,缺氧处理降低水稻根表铁膜含量;且缺氧处理时,Osfrdl1突变体根表铁膜含量低于野生型.实时定量PCR结果表明,缺氧处理显著增加OsFRDL1基因在根系表达,且根系基部的表达强度高于根尖.OsFRDL1::GUS染色结果表明,OsFRDL1::GUS报告基因主要在根系表皮细胞和维管束细胞表达;缺氧处理增加了报告基因在上述位置的表达.缺氧处理时,野生型比Osfrdl突变体根系具有较高的过氧化物酶活性.上述结果表明,缺氧处理诱导OsFRDL1基因的高量表达,使野生型与突变体相比,过氧化物酶活性维持较高的水平,从而使其铁膜生成量高于突变体.     

苜蓿中华根瘤菌烯脂酰ACP还原酶基因fabI1的功能研究

我们先前的工作表明, 苜蓿中华根瘤菌的烯脂酰ACP还原酶基因fabI1在nifA突变根瘤中表达水平降低. 本研究构建了fabI1的定点插入突变体. 与野生型相比, 突变菌株的生长速度变慢, 在高浓度NaCl培养基上的生长能力降低. 在半固体培养基上, 该突变体的涌动能力完全丧失. 在共生过程中, 突变菌株在宿主植物上延迟结瘤, 形成根瘤的能力下降. 虽然苜蓿中华根瘤菌中的烯脂酰ACP还原酶基因fabI2的序列与fabI1有66%的一致性, 但fabI2不能恢复fabI1突变体的表型, 揭示了这两个基因在功能上的差异.