促黄体生成素受体(LHR)在大鼠附睾中的表达

纤溶酶(plasmin)是一种具有广泛活性的丝氨酸蛋白水解酶,在细胞外蛋白水解中发挥重要作用。纤溶酶原激活因子(plasminogen activator,PA)特异激活纤溶酶原(plasminogen)可转化为有活性的纤溶酶。有研究表明附睾表达组织型PA(tPA)和尿激酶型PA(uPA),但其调节机制尚不清楚。我们研究了促性腺激素对大鼠附睾PA活性的调节。结果表明,人绒毛膜促性腺激素(hCG)对培养附睾tPA和uPA活性有明显刺激作用。为进一步探讨hCG在附睾内的作用途径,我们作了LH/hCG受体(LHR)mRNA的原位杂交定位,首次发现大鼠附睾表皮细胞表达LHR。这些结果表明,在体情况下LH可能通过LHR调节附睾PA活性表达,从而调节附睾内蛋白水解过程。     

纤溶酶原激活因子及其抑制因子在溶黄体过程中的作用

纤溶酶原激活因子(plasminogen activator, PA)系统所介导的细胞外基质的局部降解与许多生理和病理过程密切相关,如排卵、胚胎发生、胚泡着床、乳腺退化、纤蛋白溶解、血管生成、炎症以及肿瘤转移等.PA系统是一种激素依赖性多功能蛋白水解酶系.在此酶系中,纤溶酶原可被组织型或尿激酶型纤溶酶原激活因子(tPA或uPA)激活,并受Ⅰ型或Ⅱ型PA抑制因子(PAI-1或 2)的调节.大量实验结果表明,卵泡颗粒细胞合成的 tPA和膜-间质细胞合成的PAI-1在激素诱导下的时间和空间上的协同表达导致卵泡破裂,引起排卵,排卵后,颗粒细胞和膜-间质细胞转化为黄体,黄体是一种暂时性的内分泌器官,分泌维持妊娠所必需的孕酮(P_0).黄体在形成和退化过程中涉及一系列剧烈的形态和生化变化,如血管生成、组织转化和退化等.这些过程都涉及蛋白水解作用.目前人们对PA在黄体各生理阶段所起的作用知之甚少,本文综述了近年来我们在这方面的某些研究成果.     

恒河猴黄体中tPA,uPA和PAI-1的鉴别与其功能的研究

在大鼠和恒河猴卵巢颗粒细胞(GC)存在组织型(tPA)和尿激酶型(uPA)纤溶酶原激活因子(PA)和一种PA的抑制因子(PAI-1).在排卵、排精和子宫内膜的周期性变化中tPA和PAI-1基因在这些组织的同类细胞或不同类型细胞间的协调表达起重要作用.因为恒河猴GC和膜-间质细胞(TC)在促性腺激素作用下都能产生tPA,uPA和PAI-1,而排卵后GC和TC转化为黄体细胞(LC),后者分泌孕酮,维持妊娠.本研究目的:(1)探讨LC是     

hCG和GnRH类似物诱发大鼠卵巢tPA和PAI-1基因表达的比较研究

文献[1]报道,促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)对恒河猴颗粒细胞(GC)类固醇激素的产生有双向作用。同hCG一样,GnRHa也可直接作用于去垂体大鼠卵巢诱发排卵;由于促性腺激素诱导大鼠排卵是通过组织型纤溶酶原激活因子(tPA)及其抑制因子(PAI-1)基因的协调表达实现的,我们比较研究了促性腺激素和GnRHa诱导去垂体大     

人和恒河猴胎盘基盘分泌tPA和PAI-1部位的鉴定

tPA和PAI-1通过定向有限的蛋白水解对某些生殖过程,如卵泡破裂、黄体萎缩、精子发生和胚泡着床发挥重要作用.分娩涉及胎膜的有限破裂和母体子宫与蜕膜的分离.有报道指出,分娩前血中PAI-1和tPA水平达到高峰.胎膜的羊膜上皮细胞和绒毛膜细胞能分泌tPA,而蜕膜层能表达PAI-1(另文报道).为进一步证实tPA和PAI-1协同表达是否在分娩机制中也起重要作用,本文以人分娩胎盘和妊娠150d临产前恒河猴的胎盘基盘为材料,用免疫荧光和激光共聚焦扫描显微镜比较研究了tPA和PAI-1在这些组织中的细胞定位.实验结果表明,tPA和PAI-1集中于恒河猴子宫肌蜕膜层与分离蜕膜交界层中.在子宫肌蜕膜组织以及肌层细胞中皆为阴性反应.在蜕膜组织血管周围有明显PAI-1的分布,证实了tPA和PAI-1在母体与胎儿分离机制中起重要作用.     

组织型纤溶酶原激活因子及其抑制因子的信使核糖核酸在大鼠睾丸中的定位

纤溶酶原激活因子(tPA)及其抑制因子(PAl-1)在大鼠及恒河猴排卵中的生理功能巳得到证实.为研究tPA/PAl-1系统在精子发生过程中的作用,我们用原位杂交方法观察了二者的信使核糖核酸(mRNA)在成年及幼年大鼠睾丸曲细精管中的定位.结果证实:(1)在幼年大鼠睾丸中tPA只在某些曲细精管中表达,表达部位在支持细胞和初级精母细胞,PAl-1在间质及大部分曲细精管的初级精母细胞中都有表达;(2)在成年大鼠睾丸中tPA只在支持细胞中表达,表达水平随生精周期波动;PAl-1在间质细胞,管用细胞及各分化阶段的生精细胞中都有表达.tPA/PAl-1系统在曲细精管中的表达表明,该系统可能在精子发生过程中起生要作用.     

纤维蛋白高选择性尿激酶变体的研究

双链尿激酶(tcu-PA)作为最早进入临床使用的溶栓药物,由于它对纤维蛋白(fibrin)没有选择性,大剂量静脉注射时会使血液中纤维蛋白原(Fibrinogen)降解,从而引发出血,因此在临床应用上受到限制.单链尿激酶(scu-PA,又称尿激酶原)是tuc-PA的前体,但它不同于一般的酶原,具有一定的内在纤溶酶原激活剂(PA)活性,而且能选择性地在Fibrin表面活化纤溶酶原,从而选择性地溶解血栓凝块.scu-PA经纤溶酶(Plasmin)的作用在Lys158-Ile159肽键断裂,转变成tcu-PA,由Cys148和Cys279间形成的一对二硫键将两条钛链连接、我们以前的工作证明尿激酶A链的Lys151和Arg154氨基酸残基是导致双链尿激酶对纤维蛋白低选择性的结构基础.本文通过定点突变手段构建了变体尿激酶原(Glu151-Gly154-rscu-PA)基因(以下简称mscu-PA),并在E.coli中获得表达、测定了表达产物的双链形式mtcu-PA及未突变的重组尿激酶原(rscu-PA)及其双链形式(rtcu-PA)对Fibrin的亲和性以及对血浆中纤维蛋白的选择性,结果证明所得变体双链尿激酶对Fibrin具有较高的选择性.     

铜离子抑制腺苷同型半胱氨酸水解酶的活性

利用 E.coli JM109菌株高效表达和纯化了重组人的 S-腺苷同型半胱氨酸（AdoHcy）水解酶.初步研究了铜离子对AdoHcy水解酶活性的影响.结果表明,Cu2 可以抑制酶的活性,其抑制能力随着Cu2 浓度增加而增大;Cu2 对 AdoHcy水解酶活性抑制是一个时间依赖的过程,其表观速率常数为（1.08±0.15）min-1.自然底物腺普（AdoHcy）的存在可以明显减弱 Cu2 抑制酶活性的能力。研究结果表明,Cu2 可能与酶的自然底物以某种类似方式竞争结合,从而抑制酶的活性.     

酪蛋白平板法检测蚯蚓纤溶酶活性

根据蚯蚓纤溶酶能水解酪蛋白(Casein)的性质,建立了酪蛋白平板检测蚯蚓纤溶酶活性的方法.与纤维蛋白平板法相比较,酪蛋白平板法具有铺板简便、灵敏度高等优点,能检测的最小样品量为0.23μg,而纤维蛋白平板法能检测的最小样品量为0.53μg.     

编码蚯蚓纤溶酶组分A基因的cDNA克隆及表达

蚯蚓纤溶酶组分A是赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)体内纤溶酶的主要组分之一，具有双重纤溶活性，用逆转录PCR(RT—PCR)的方法从赤子爱胜蚓中克隆了编码蚯蚓纤溶酶组分A的cDNA，由其推测的氨基酸序列与丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶家族的成员具有较高的同源性，而且具有其保守的催化位点，表明该蛋白质可能是胰蛋白酶家族的成员．将上述cDNA导入大肠杆菌的表达载体pQE31和pMAL—c2X，构建表达质粒pQE—efea和pMAL—efea，这2个表达质粒均可以在大肠杆菌苗株M15中诱导表达出与预期大小相近的重组蛋白。其中，pQE—efea表达的His6—EFEa主要以包涵体形式存在，而pMAL—efea表达的重组蛋白MBP—EFEa是可溶性的，并且具有纤溶活性。     

纤溶酶原激活因子和抑制因子在生殖中的作用

综述了由纤溶酶原激活因子（ＰＡ）和抑制因子（ＰＡＩ）所调控的局部定向纤蛋白水解在生殖作用研究中的最新进展。组织型（ｔ）ＰＡ（ｔＰＡ）和Ｉ型ＰＡＩ（ＰＡＩ－１）在卵巢不同细胞中的协同表达参与排卵和黄体（ＣＬ）萎缩调控过程,在早期黄体组织中尿激酶型（ｕ）ＰＡ（ｕＰＡ）和ＰＡＩ－１活性明显增高,ｕＰＡ和ＰＡＩ－１的协同表达可能与黄体形成过程中组织重建和血管发生密切相关。实验证明,ＰＡ系统在精子发生和成熟     

卵泡生长、分化和闭锁的调控

研究卵泡生长启动和分化对于了解雌性生殖机制至关重要. 哺乳动物卵细胞在胚胎发育过程中已经形成, 并且在生殖嵴每个卵原细胞都与若干原始卵泡细胞组合分化成一个原始卵泡. 出生后原始卵泡数不再增加. 原始卵泡生长启动的分子机制至今还不清楚. 相关研究的最新进展表明: (ⅰ) 原始卵泡的生长启动可能主要受卵泡内外产生的生长因子、激活素和孤儿受体等调节, 而可能不受FSH调节; (ⅱ) 在颗粒细胞上一旦分化出现FSH受体, FSH即与雌激素以及激活素/抑制素、卵泡抑素一起成为决定卵泡分化倾向的主要因素; (ⅲ) 卵泡闭锁可起始于颗粒细胞或卵母细胞凋亡两种形式, 卵母细胞中组织型纤溶酶激活因子(tPA)蛋白活性的提前表达将引发卵母细胞凋亡.     

胰岛素介体的产生与诱导的激素活性的关系

最近对胰岛素作用机理的研究指出,胰岛素与它的靶细胞受体结合后,激活细胞膜上的蛋白水解酶,或磷脂酶C而导致膜上某种糖蛋白或磷脂水解,产生多肽样或磷脂样的化学介体。它们能在无细胞系统中模拟胰岛素的各种作用,如,调节胰岛素敏感的酶的活性,以及在完整细胞中模拟胰岛素的一些生物功能,包括调节cAMP水平、腺苷酸环化酶活性、抗     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)mRNA5′端非翻译区(UTR)对其表达的调控

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在人体纤溶与凝血的平衡调控中发挥重要作用,而且在治疗心血管栓塞性疾病方面具有广阔的应用前景.t-PA在人体内的表达受严格调控,其mRNA具有较长的非翻译区序列.我们曾报道了t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的调控,为研究长约209nt的5′-UTR序列对t-PA表达的影响.本文采用反转录-PCR技术从黑色素瘤细胞中克隆出t-PA cDNA 5′端序列,在体外和体内2个系统中研究了5-′UTR序列对t-PA表达的影响.     

胚乳特异sbeⅡa启动子在小麦中的评价及特性分析

淀粉的合成是一个复杂的生化过程. sbeⅡa基因是淀粉合成过程中的关键酶基因之一, 在小麦籽粒成熟过程中对淀粉, 尤其对支链淀粉的生物合成调控起重要作用. 为了解sbeⅡa基因的调控机理及其胚乳特异表达特性, 利用APCR方法克隆了sbeⅡa启动子3094 bp片段, 并对该片段进行测序, 同时利用GUS瞬间表达体系对sbeⅡa启动子序列进行不同片段的功能缺失研究. 研究结果表明, 3094 bp序列(存在于sbe.g融合体中)具有稳定的启动子活性, 而5′或3′缺失体的启动子活性明显降低. 在sbeⅡa启动子中间缺失体中, 一些缺失体仅有微弱活性, 但sbe.e在缺失–1579~–1210 bp片段情况下, 却具有比sbe.g(含启动子全长序列)还要高的启动子活性. 研究初步证明, 一些固定序列(motifs), 如 –300 bp因子、G盒以及醇溶蛋白盒(Prolamin box)等作为正调控因子在决定启动子胚乳特异表达模式中是必需的, 而且在–1579~–1210 bp片段中也存在一些负调控因子或固定序列. 在瞬间表达检测体系中, 小麦胚乳组织年龄对检测结果有着重要影响.     

水稻Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因OsWIP1-2的诱导表达及其抑制活性

克隆了水稻的WIP1基因, 该基因属于Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(BBI)家族. RNA杂交实验结果显示该基因的表达受伤害和茉莉酮酸的诱导, 表明它在植物防御反应中起着重要的作用. 将此基因克隆到表达载体pET28a, 并在大肠杆菌中表达融合蛋白. 分别用胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶为底物检测纯化的融合蛋白的抑制活性, 发现融合蛋白具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 但没有对胰蛋白酶的抑制活性; 同时发现融合蛋白C端的融合残基对蛋白酶抑制活性有重大影响, 具有C端(His)₆纯化标签的融合蛋白不具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 而有天然C端序列的融合蛋白具有胰凝乳蛋白酶的抑制活性, 这暗示了过长的C末端序列可能会影响WIP1蛋白的正确折叠. 蛋白酶抑制活性分析表明水稻Bowman-Birk抑制剂家族的成员可能在结构和功能上均发生了分化.     

C3—C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶P—蛋白亚基上游调控序列在转基因水稻中的表达

将C3-C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶(GDC)P-蛋白亚基基因(gdcsP)的上游调控序列与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因编码区以及CaMV终止子融合,构建植物表达载体.采用农杆菌介导方法转化水稻,并在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.结果表明,在水稻中gus嵌合基因特异地在木质部和韧皮部表达,在不同器官及组织中表达活性也有所差异,其中以根中最高,茎秆次之,叶再次,而在成熟胚乳中没有表达.在转基因水稻中,gdcsP启动子的表达也受水稻发育时期的调控,随植物组织成熟度的增加而降低.     

p300和HDAC3介导的可逆的乙酰化作用参与调控IL-18 p1启动子荧光素酶报告基因活性

IL-18是调节先天性免疫和获得性免疫的重要细胞因子, 在Th1的发育中起着重要作用. p300是一种具有组蛋白乙酰化酶活性的转录辅因子. HDAC3是一种组蛋白去乙酰化酶. 通过一系列共转染实验证实, p300能够刺激外源IL-18 启动子活性, 而HDAC3则抑制其活性. p300的乙酰化酶活性对于增强IL-18 p1启动子荧光素酶报告基因激活是必需的. p300能提高转录因子c-Fos介导的IL-18启动子荧光素酶报告基因的活性, 这种作用能被HDAC3抑制. p300对于内源IL-18 mRNA 合成有增强作用. 首次证实了组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶参与IL-18 p1启动子活性的调控, 为进一步研究IL-18基因表达调控的机制奠定基础.     

胰高血糖素分离纯化的研究

胰高血糖素为由29个氨基酸组成的多肽激素,为胰腺α-细胞所合成.具有促进肝糖元水解而升高血糖等作用.近年来发现胰高血糖素具有增强心肌收缩力等多种作用而引起普遍重视.由于胰高血糖紊结构松散易受酶的攻击,在中性条件下难溶,过酸、过碱均易丧失活性为分离纯化带来一定困难.     

重组逆转录病毒介导的人组织型纤溶酶原激活剂基因转移及在哺乳动物细胞中的持续表达

心脑血管疾病是全球发病率和死亡率最高的疾病,其中血栓性疾病危害最大,近年来迅速崛起的基因治疗为这类疾病的有效防治带来了希望。人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t-PA)是目前晕为有效的溶栓药物之一,其缺点是价格昂贵、半寿期短,而血栓性疾病住住需要长期给药,故难以推广使用。如果将t-PA基因导入体细胞持续表达具有纤溶活性的产物供机体利用,可望达到防治血栓性疾病的远期效果。重组逆转录病毒载体已成功地用子多种疾病的基因治疗。为了探索这一途径治疗血栓性疾病的可行性,本研究首先用含有t-PA基因的重组逆转录病毒感染体外培养的哺乳动物细胞,然后对感染细胞纤溶活性的变化进行了长期观察。