猪肾氨基酰化酶Ⅰ的初步晶体学研究

<正>氨基酰化酶Ⅰ(aminoacylase I,ACY-1)(3.5.1.14)主要存在于哺乳动物的肾脏和微生物中,是生物体进行氨基酸代谢时一个重要的水解酶,它可逆地催化酰化L-氨基酸的水解反应.该酶由772个氨基酸组成,分子量为85.500ku,是一个寡聚酶,由两个相同亚基组成,每个亚基含有一个锌离子.猪肾ACY-1与人的ACY-1的核酸序列有88.3%的同源性,氨基酸序列的同源性为87.7%.将猪肾ACY-1的氨基酸序列放在PROSITE数据库中检索,除了几个潜在的蛋白激酶磷酸化的位点和2个可能的N-糖基化位点外,没有其他明显的特征.把猪肾ACY-1的核酸序列和氨基酸序列与EMBL/GenBank和SwissProt Database中的序列进行比较,除了由E.coli表达的酰氨酶(amidase,succinyl-diaminopimelate desuccinylase),没有发现它与其他蛋白质有同源性,Wilbur-Lipman Algorithm统计分析表明,酰氨酶与猪肾ACY-1序列在400个氨基酸长度内有24%的等同性、这些结果提示,ACY-1是一类新的含锌金属蛋白.张艳等人用CD和FTIR谱对它的二级结构进行了研究.     

氨基酰化酶在低浓度脲溶液中的失活并非解聚所致

氨基酰化酶(Aminoacylasc,EC3.5.1.14)是一个含金属锌离子的二聚体酶,亚基分子量约为43 000.Zn~(2 )位于每个亚基的活性部位上,且为酶的活性所必需,过去的研究结果表明锌离子对酶活性部位结构有一定的稳定作用,最近报道的氨基酸序列表明,该酶分子中有16个色氨酸残基和18个酪氨酸残基.我们已经知道16个色氨酸残基中部分位于分子     

水稻线粒体tRNATrp的种属特异性氨酰化

为了研究原核生物和真核生物(细胞质)色氨酰tRNA合成酶(TrpRS)对线粒体tRNA^Trp识别的种属特异性, 构建了7个水稻线粒体tRNA^Trp三位点(G73, U72, A68)的单点或多点突变的突变体. 这些突变基因, 经体外转录后分别用枯草杆菌(B. subtilis)和人色氨酰tRNA合成酶(TrpRS)进行氨酰化反应, 并测定它们的动力学常数. 结果表明, 与野生型水稻线粒体tRNATrp相比, 7个突变体的转录产物被B. subtilis TrpRS氨酰化的活力分别降低了53.33%~99.79%, 被人TrpRS氨酰化的活力却分别提高了4~330倍, 其中以MPH7(水稻线粒体tRNATrp的三碱基(G73, U72 和C68)全部突变为人tRNA^Trp的三碱基序列)的氨酰化活力改变最大. 实验结果证明, 与真核生物和原核生物细胞质tRNA^Trp的种族特异性类似, 水稻线粒体 tRNA^Trp的种属特异性元件也主要处于氨基酸接受茎的识别位碱基、第一和第五对碱基对, 亦即识别位碱基G73, 氨基酸接受茎上的两个碱基对G1/U72和U5/A68. 本研究为线粒体 tRNATrp起源于真细菌的推论提供了实验依据.     

水稻线粒体tRNATrp的种属特异性氨酰化

为了研究原核生物和真核生物（细胞质）色氨酰tRNA合成酶（TrpRS）对线粒体tRNA^Trp识别的种属特异性,构建了7个水稻线粒体tRNA^Trp三位点（G73,U72,A68）的单点或多点突变的突变体．这些突变基因,经体外转录后分别用枯草杆菌（B．subtilis）和人色氨酰tRNA合成酶（TrpRS）进行氨酰化反应,并测定它们的动力学常数．结果表明,与野生型水稻线粒体tRNA^Trp相比,7个突变体的转录产物被B．subtilis TrpRS氨酰化的活力分别降低了53．33％-99．79％,被人TrpRS氨酰化的活力却分别提高了4～330倍,其中以MPH7（水稻线粒体tRNA^Trp的三碱基（G73,U72和C68）全部突变为人tRNA^Trp的三碱基序列）的氨酰化活力改变最大．实验结果证明,与真核生物和原核生物细胞质tRNATrp的种族特异性类似,水稻线粒体tRNA^Trp的种属特异性元件也主要处于氨基酸接受茎的识别位碱基、第一和第五对碱基对,亦即识别位碱基G73,氨基酸接受茎上的两个碱基对G1／U72和U5／A68．本研究为线粒体tRNA^Trp起源于真细菌的推论提供了实验依据．     

一种新型高分子量麦谷蛋白亚基的鉴定及其与同源蛋白间氨基酸序列的差异

粗山羊草（Aegilops tauschii）是普通小麦（Triticum aestivum）D染色体组的祖先供体种,粗山羊草的Glu-ID^t位点所编码的高分子量麦谷蛋白亚基的类型较普通小麦Glu-1D位点所编码的种类更丰富,从粗山羊草中筛选到一个电泳迁移率比普通小麦Dy12更快的亚基Dy13^t,对Dy^t亚基基因的全长编码区进行了DNA序列测定后发现该亚基的编码区含624个密码子;由其决定的氨基酸序列的长度,在已知D染色体组编码的所有y型高分子量麦谷蛋白亚基中是最小的,因此认为Dy13^t是高分子量麦谷蛋白亚基的新成员,比较了Dy13^t与小麦族植物A,B,D,R染色体组所编码的y型高分子量麦谷蛋白亚基在氨基酸序列上的差异。     

SARS相关病毒与鼠肝炎病毒S蛋白的同源暗示一个潜在受体结合区的存在

最近, 一种新的冠状病毒被确定为近期爆发的严重急性呼吸综合征(SARS)的病原体. 虽然人们对人冠状病毒229E已经有了较多的研究, 而且其受体结合位点也被确定在S蛋白第417~547个氨基酸残基之间. 但是, 这一区域与新分离的SARS相关病毒(香港株, CUHK-W1)没有任何同源性. 有意思的是, 已知的各种冠状病毒S蛋白S1亚基的序列比对和进化分析显示, 鼠肝炎病毒(MHV)与SARS相关病毒的同源性最高. 而且, MHV的S蛋白上负责受体结合的重要位点(第62~65和第214~216位氨基酸残基)与SARS相关病毒的相应区域(第51~54和第195~197位氨基酸残基)高度同源. 这些生物信息学的分析结果可能对研究SARS相关病毒的受体结合位点和病毒侵染靶细胞的机理有所帮助, 进而为设计抗病毒药物和疫苗提供新靶点.     

大肠杆菌青霉素G酰化酶Trp~(572)残基的定点突变研究

大肠杆菌青霉素G酰化酶(PGA,EC3、5、1、11)催化青酶素G侧链的水解,是半合成抗生素工业中的重要应用酶。生物合成的PGA由一个α亚基和一个β亚基共同组成,它的一级结构已全部搞清,但其空间结构尚未见报道,Mahajan曾用2-硝基苄氧磺酰氯和2-羟基     

Allexivirus属的一个新成员——大蒜病毒E的基因组全序列测定和系统树分析

测定了一个从浙江余杭大蒜中分离到的Allexivirus属成员的基因组全序列,单链正性病毒基因组含8451个核苷酸,6个ORF,与其他Allexivirus属成员的基因组全序列的核苷酸同源性仅为62.8%～64.8%;ORF1～ORF6编码蛋白的氨基酸同源性分别为67.6%～78.5%,55.4～66.2%,56.7%～66.4%,40.3%～55.6%,66.3%～79.9%和52.2%～68.8%,进一步分析显示,此病毒与其他病毒的差异和该属中远缘病毒间的差异相似,外壳蛋白核心区域氨基酸序列同源性仅为63.9%～79.8%,远低于该属不同病毒的国际分类标准,应归类为Allexivirus属的新成员,命名为大蒜病毒E,病毒不同编码蛋白序列的进化树分析也进一步证明了该病毒与其他病毒的亲缘关系。     

钙调神经磷酸酶在CaM,Mn~(2+)存在时的构象变化

钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)是由A,B两亚基1:1组成的二聚体酶.A亚基是CaN的催化亚基,上有钙调素(CaM)、B亚基和金属离子结合位点.B亚基是调节亚基,上有4个Ca~(2+)结合位点,在维系酶的活性构象方面起着重要的作用.肖方祥等用Mn~(2+)作为Ca~(2+)探针进行了CaN,CaN+CaM结合Mn~(2+)的ESR研究,其结果表明,CaN上有2个Mn~(2+)结合位点,然而分离的A,B亚基上分别有2个、4个Mn~(2+)结合位点,CaN-CaM复合物     

甲型H1N1流感病毒北美毒株的分子特征

以10个甲型流感病毒北美毒株的基因PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, NS和M进行遗传进化分析, 并用不同的软件对PB2, HA, NS1和M2蛋白氨基酸序列、糖基化位点及抗药性位点分析. 结果表明, 甲型流感病毒北美毒株的基因片段是一个来源于不同宿主、不同地域的重组株. HA蛋白氨基酸序列分析表明, 北美毒株HA蛋白的裂解位点氨基酸序列均为IPSIQSR↓G, 不具有高致病性流感病毒的特性, 同时NS1蛋白第92位氨基酸残基由天冬氨酸突变为谷氨酸(Asp→Glu), PB2蛋白氨基酸序列的第627位均为谷氨酸(E), 这些特性表明对人具有明显的亲和性, 但推测对人具有较低的致病力. M2蛋白的同源建模表明了北美毒株M2蛋白的药物敏感位点突变为抗药型位点, 推测北美毒株具有抗金刚烷胺类药物的结构特点, NA蛋白序列分析表明了北美毒株仍然对神经氨酸酶抑制剂类药物敏感. 这些研究结果对于我国预防和控制甲型流感北美毒株具有重要的参考价值.     

一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.     

尾状山羊草C基因组特异重复序列的克隆

pAeca 2 1 2序列长 2 0 4bp ,G +C含量为 5 1 % ,除着丝点和次缢痕外 ,它散布于C基因组的 7对染色体上 .与基因库登记注册的 31 6 893个DNA序列进行的同源性比较表明 ,它是尾状山羊草C基因组的一个新的散布特异重复序列 .在供试的禾本科植物中 ,除黑麦外 ,pAeca 2 1 2与其他基因组几乎无杂交信号 ,是研究小麦族起源与进化及C染色质检测的一个有效的分子标记 .     

优系青蒿法呢基焦磷酸合酶基因的克隆和酶学分析

从青蒿(Artemisia annua L)高产株系025的cDNA文库中克隆到了一个编码青蒿法呢基焦磷酸合酶(AaFPS1)的cDNA(af1). 序列分析表明, 这一cDNA编码一个含343个氨基酸残基的蛋白质, 分子量为39 kD. 推导出的氨基酸序列与来自其他植物、哺乳动物及酵母的FPS相似, 也包含异戊烯基转移酶和聚异戊烯基合酶所共有的5个保守域. 此cDNA在大肠杆菌中的表达产物表现出明显的FPS酶学活性. 通过离子交换层析纯化后, 进一步测定了其酶学动力学. 上述结果将进一步推动青蒿素生物合成分子调控的研究.     

水稻咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因（CCoAOMT）达特性分析

咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素生物合成途径中的关键酶．从水稻(Oryza sativa L ssp japonica)中分离了CCoAOMT基因家族的3个成员OsCOA1，OsCOA20和OsCOA26．序列分析表明，OsCOA1基因由4个外显子和3个内含子组成，OsCOA20和OsCOA26则具有3个外显子和2个内含子．这3个基因与其他植物同类CCoAOMT氨基酸同源性较高，达75．43％，并具有CCoAOMT基因特有的保守序列元件．系统进化树分析表明，OsCOA1与玉米中CCoAOMT具有较近的亲源关系，OscOA20和OsCOA26则属于另一分支．Northern印迹和组织原位杂交结果显示，3个基因的mRNA在水稻的各组织均有积累，在幼叶的厚壁组织和维管束大量表达，说明该基因家族的3个成员与水稻的木质化进程关系密切．     

BmK AS,一种新型骨骼肌Ryanodine受体激动肽的氨基酸序列

前文曾报道从东亚钳蝎毒中纯化了一个新型骨骼肌Ryanodine受体激动肽(BmK AS).本工作将进一步报道该活性肽的完整氨基酸序列.由它的序列(共66个残基)计算出的最小分子量为7698u与经电喷雾质子光谱测定的7696.26u值基本吻合.其分子结构与同一蝎毒中已知的各类Na~ 通道配体间的同源性较差.但与一种独特的非洲蝎所产抗昆虫毒素(AaH IT),同属Na~ 通道配体间却存在着>80%的相似性.1 材料与方法BamK AS的纯化参照文献进行.分别用SDS-PAGE电泳法和电喷雾质子光谱仪鉴定纯化样品的纯度和分子量.     

猪腮腺分泌蛋白基因序列和蛋白结构比较分析及组织表达谱鉴定

腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein, PSP)是唾液中特异性高表达的一种蛋白, 其功能与抗菌有关. 根据人、牛和鼠的PSP基因cDNA序列设计简并引物, 通过3′和5′RACE获得猪PSP基因全长cDNA序列. 同源性分析表明, 在核苷酸和氨基酸水平上, 猪、人和牛PSP基因同源性较高. 在蛋白二级和三级结构上, 猪与人PSP的结构也非常相像, 与抗菌蛋白BPI结构类似. 蛋白功能分析发现, 猪PSP基因氨基末端含有一个特殊结构Leu-X(6)-Leu-X(6)-Leu-X(7)-Leu-X(6)-Leu-X(7)-Leu-X(6)-Leu-X(6)-Leu, 可能对其功能有一定的意义. 通过RT-PCR, 斑点杂交和Northern杂交, 证明猪PSP基因是组织特异性表达, 只在腮腺和下颌下腺表达.     

植物NAD-IDH基因克隆及体外表达酶活力分析

植物NAD⁺-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)是一多功能酶. 以拟南芥生态型“Columbia gl1”及甘蓝型油菜三系“陕2A”, “陕2B”和“垦C1”的叶片为材料, 采用RT-PCR方法成功地从每种植物材料中分别克隆了3种NAD-IDH不同亚基基因. 同源性搜索发现, 来源于油菜的克隆基因是新基因. 将克隆基因的功能蛋白编码区整合到pMID1多克隆位点, 构建表达重组体, 均能在体外翻译系统中高效地表达出特异目的蛋白. 亚基0, 亚基1和亚基2基因转录本加入到含终浓度为36 μg/mL的二硫键异构酶的体外翻译系统, 体外表达产物中检测到NAD-IDH酶活力. 不同基因种类及转录本分子比的体外表达产物的酶比活力比较表明, NAD-IDH由3种亚基组成, 缺一不可, 缺少亚基0是致命的, 缺少亚基1或2中的任何一个对酶活力的损伤是严重的. 同时发现, 来源于陕2A和陕2B的亚基1基因转录本中存在碱基缺失现象, 从而发生移框突变或无义突变, 使突变亚基不表现正常亚基1功能, 导致油菜品系间叶片NAD-IDH酶比活力存在差异.     

水稻肉桂酰辅酶A还原酶基因的克隆与表达分析

用现有的OsCCR 基因片段筛选水稻核DNA文库, 获得了长为3045 bp的核DNA. 它包含4个内含子和5 个外显子, 推测的可读框长为337个氨基酸. OsCCR与其他植物中同类酶在氨基酸水平上有70%的相似性和30%的相同性, 含有保守的辅酶Ⅱ(NADP)结合位点及可能为该酶催化位点的特征序列. Northern杂交证实, 该基因产物广泛存在于水稻根、茎和叶等各组织中, 在茎中表达量较高. 组织原位杂交结果表明, OsCCR 基因在维管束及新生侧根中有强烈的表达信号, 与该基因编码的酶的木质素合成特性相吻合. OsCCR 基因的克隆、组织定位及生物化学方面的研究将有助于深入了解木质素形成的分子机理, 并为通过遗传工程的手段改善植物的机械性能以获得低木质素纸浆原料打下基础.     

从云南分离的烟草曲顶病毒为菜豆金色花叶病毒属的一个新种

从我国云南省保山地区烟草上表现曲顶症状的植株上分离获得病毒分离物Y1,经粉虱传毒及粒子形态观察,证明为菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）病毒,用14种单克隆抗体进行三抗体夹心ELISA测定,结果表明Y1与我国及巴基斯坦、印度等国报道的双生病毒的抗原表位型均不同,对Y1基因组DNA-A的全序列进行了分析,全长2746个核苷酸,其中病毒链含有两个ORF,互补链含有4个ORF,Y1与其他双生病毒基因组DNA-A全序列、基因间隔区序列及各ORF编码的氨基酸序列的比较分析表明,Y1是一种新的Begomovirus病毒,定名为烟草曲顶病毒,英文名为Tobacco curly top virus,简称TCTV,TCTV全基因组与印度报道的番茄曲叶病毒和番木瓜曲叶病毒的同源性最高,达85%,而其CP基因与巴基斯坦棉花曲叶病毒分离物72b高度同源,氨基酸水平的同源性达98%。     

叶绿体ATP合酶ε亚基缺失突变对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度及其ATP合成能力的影响

在E. coli中表达菠菜叶绿体ATP合酶ε亚基及其N端或C端部分氨基酸残基缺失突变体的蛋白. 经初步纯化, 测定将它们加入到叶绿体悬浮液中后对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度及其循环和非循环光合磷酸化活力的影响, 以及它们与缺失ε亚基的类囊体膜重组后的ATP合成活力. 结果显示, 外加ε亚基或缺失突变的ε亚基蛋白于叶绿体悬浮液中对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度和光合磷酸化活力均有促进作用. N端缺失突变的ε亚基随着其缺失氨基酸残基数目的增加(从1→5个), 对叶绿体的毫秒延迟发光快相强度和光合磷酸化活力的促进作用逐渐减弱, 且与缺失ε亚基的类囊体膜重组后的ATP合成活力也逐渐减小; 但是C端缺失突变的ε亚基随着其缺失氨基酸残基数目的增加(从6→10个), 其促进作用反而逐渐增强, 且与缺失ε亚基的类囊体膜重组后的ATP合成活力也逐渐增大, 但均仍不如野生型ε亚基的高. 这些结果表明, 叶绿体ATP合酶ε亚基的N端结构可通过调节ε亚基的堵塞跨膜质子泄漏能力影响合酶的ATP合成能力, 叶绿体ATP合酶ε亚基C端区域对于ATP的合成具有微妙的调节作用.