Pericardin蛋白的表达纯化以及多克隆抗体的制备

Pericardin 基因是果蝇心脏发育的标记基因,在果蝇心脏发育过程中起着重要的作用.从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板.通过生物信息学分析,选择Pericardin 基因抗原亲水区,选取特异性高的片段.将PCR片段克隆到原核表达pET28a(+)载体上,转入E.coli后通过IPTG(Isopropyl β-D-thiogal actoside)诱导表达His融合蛋白,蛋白经分离纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.经Western Blot 检测抗体的效价和特异性.结果显示,获得了Pericardin原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Pericardin 多克隆抗体,为Pericardin 功能的进一步研究奠定了基础.     

果蝇nulp1特异性多克隆抗体制备及检测

为了利用果蝇模型研究nulp1蛋白在早期心脏发育中的功能,采用PCR技术扩增出果蝇nulp1基因的部分编码区并插入到pET28a表达载体中.之后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)Rosetta( DE3);通过IPTG诱导表达His-nulpl融合蛋白,该融合蛋白采用Ni2+金属螯合层析纯化后,免疫新西兰兔制备了多...     

P转位子诱变的果蝇心脏发育基因的突变(Ⅰ)——第2染色体基因突变

果蝇和脊椎动物的心脏早期发育具有平行的基因控制机理，果蝇是替代人体心脏进行基因功能研究的理想模式．利用Ｐ转位子作为诱变工具，诱发果蝇第二染色体基因突变，筛选与心脏发育有关的基因．初步结果表明，有３个第二染色体隐性致死突变基因在心脏组织有ｌａｃＺ表达，并且观察到有心脏前体细胞的突变表型．这预示在这３个致死系中，Ｐ转位子可能插入到与心脏发育有关的基因中或这些基因的附近．这３个致死系是值得进一步研究的候选者     

P转位子诱变的果蝇心脏发育基因的突变（Ⅰ）

果蝇和脊椎动物的心脏早期发育具有平行的基因控制机理，果蝇是替代人体心脏进行基因功能研究的理想模式，利用Ｐ转位子作为诱变工具，诱发果蝇第二染色体基因突变，筛选与心脏发育有关的基因，初步结果表明，有３个第二染色体隐性致死突变基因在心脏组织有ｌａｃＺ表达，并且观察到有心脏前体细胞的突变表型，这预示在这３个致死系中，Ｐ转位子可能插入到与心脏发育有关的基因中或这些基因的附近，这３个致死系是值得进一步研究的候     

果蝇Mef2基因多克隆抗体的制备及检测

为了在果蝇模型中进一步研究Mef2基因的功能,制备了Mef2多克隆抗体.以果蝇cDNA文库为模板,PCR扩增出亲水性和特异性均好的果蝇Mef2基因片段,将其克隆入pET-28a原核表达载体,然后将重组质粒转化入大肠杆菌菌株Rossetea,用IPTG诱导表达融合蛋白.融合蛋白先经Ni-IDA凝胶柱纯化,再免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,然后用不同浓度的抗体分别进行Western-blot实验检测抗体效价.所得结果显示获得了较高效价的果蝇Mef2多克隆抗体.     

果蝇血液发育标记基因mrj的多克隆抗体制备及检测

mrj是黑腹果蝇中一个蛋白编码基因.根据已报道的mrj基因序列,利用生物信息学分析选取果蝇mrj基因抗原亲水区,通过PCR扩增出其部分编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上.经酶切及测序鉴定质粒构建成功后,将重组质粒(pET-28a-mrj)转入Rosetta菌后通过IPTG(Isopropy1β-D-thiogalactoside)诱导表达出带His标签的重组融合蛋白后用镍柱纯化.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体的效价和特异性.     

斑马鱼loc558117基因的多克隆抗体制备

loc558117基因是trim45在斑马鱼中的同源基因,小鼠及果蝇研究结果表明该基因与血细胞发育有关.利用PCR技术扩增斑马鱼loc558117基因部分编码区,并将其插入到原核表达载体pET-28a中,经过酶切和测序鉴定后,将重组质粒(pET-28a-loc558117)转入Rosseta感受态细胞,通过IPTG诱导...     

拟南芥同源转换盒基因A21反义RNA基因重组体的构建及转化

A21是拟南芥的一同源转换盒基因,以发育旺盛的组织中高度表达。采用反义RNA技术,将该基因cDNA 5′端自然410bp反向克隆到pTA7002后,构建了可在植物中调控表达A21反义RNA基因片段的重组体。以根癌农杆菌浸渍法将重组体转入拟南芥Landsberg erecta生态型植株中,筛选到转A21反义RNA基因的拟南芥植株。反义基因可在甾类激素诱导下表达出A21的反义RNA。经初步诱导表达,变异性状表现为顶端生长抑制型。     

斑马鱼hand2基因的克隆、抗体制备及分析

为利用斑马鱼动物模型进一步研究bHLH转录因子家庭重要成员hand2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼hand2基因.将所得片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并通过IPTG诱导表达出GST-Hand2融合蛋白,经GST亲和层析法纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,利用western blotting和免疫组化的方法对抗体进行分析.分析表明:斑马鱼hand2基因成熟肽编码区含有627 bp,编码208个氨基酸,与人Hand2蛋白的同源性达到83%;IPTG诱导表达后,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71%,经GST纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带.融合蛋白相对分子质量约为49 000.分析表明,制备的抗体具有很好的特异性.     

建立果蝇心脏发育候选基因CG3295的基因敲除系

果蝇CG3295基因是哺乳动物基因RMND5在果蝇中的同源物,其功能未知.利用P转座子敲除技术进行果蝇CG3295基因的敲除研究,将果蝇14234系的P转座子与△2-3系中的转座酶基因组合到同一个体,使P转座子在体内敲掉目的基因.从后代挑选不含P转座子和转座酶基因的500头雄蝇分别与缺失了CG3295基因的测交系交配,从后代筛选获得20个CG3295基因敲除候选系.进一步利用Hand-GFP系使候选系的心脏表达绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下根据候选系是否表现心脏突变表型鉴定敲除系,最后获得了12个表现心脏突变表型的CG3295基因敲除系.     

红麻微卫星DNA的分离

分别采用RAPD、锚定PCR和磁珠捕获等3种方法富集含微卫星序列的红麻基因组DNA片段,并连接到pMD18-T载体,构建基因组文库.然后以通用引物M13F,M13R和根据微卫星核心序列所设计的引物[VRV(CT)12或VRV(TG)12],用PCR方法直接对文库筛选,并将获得的阳性克隆进行测序.分别从RAPD,锚定PCR和磁珠捕获3种富集方法构建的基因组文库中获得6,23,19个微卫星位点.     

Bacillus subtilis碱性果胶酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

针对实验室筛选获得的Bacillus subtilis,设计2对引物扩增出编码碱性果胶酶基因pelG1和pelG2,酶切后分别连接到大肠杆菌分泌表达载体pET-22b(+)多克隆位点上得到重组载体,在BL21( DE3)中表达并进行了分析.     

利用Ti质粒介导的二元载体法向小麦导入几丁质酶基因的初步研究

以小麦ＮＰＦＤ、９４－１６７、鄂恩一号３个品种的幼胚、幼穗为受体材料,利用Ｔｉ质粒介导的二元载体法,将含有几丁质酶基因的质粒ｐＢｃｈ导入小麦,经过抗性筛选,ＰＣＲ检测,获得一株转基因小麦,证实了外源几丁质酶基因已整合到小麦基因组中．     

人源抗菌肽LL-37在烟草中的表达

为探讨用植物生物反应器生产LL-37的可行性,利用DNA重组技术将LL-37与植物病程相关蛋白信号肽基因融合,经测序证实序列和阅读框正确后,连接到质粒pBin438上,构建含LL-37 cDNA植物分泌型表达载体pBin/LL-37.通过根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacience)介叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum.NC-89).用PCR和Western blot对转化植株进行分子鉴定.80%转基因植株表达重组LL-37多肽.T0代转基因烟草的蛋白粗提物有抑制Staphylococcus aureus和Escherichia coli生长的活性.LL-37基因在转基因烟草中成功表达,提示用植物表达系统生产活性LL-37蛋白是可行的.     

CCoAOMT基因反义表达载体的构建及转化苎麻的研究

采用RT-PCR的方法,克隆烟草木质素合成关键酶咖啡酰甲基转移酶(CCoAOMT)基因并测序．构建CCoAOMT基因反义表达载体,通过农杆菌介导法对苎麻进行遗传转化,得到转基因植株．采用PCR方法对其进行分子检测．为利用基因工程技术,创造适合我国国情的环保型低木质素苎麻转基因新品种奠定了基础。     

nodD基因的克隆及其导入大豆根瘤菌工程菌株的构建

以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA作为模板,采用PCR技术,克隆结瘤基因nodD编码区序列;利用DNA重组技术,将nodD基因连到lac启动子的下游,通过luxAB基因标记的质粒载体pTR102构建表达载体pTR102-Plac-nodD,采用三亲本杂交的方式,将构建的表达载体转化土著大豆根瘤菌,构建转基因工程菌株,为研究转基因工程菌株对大豆结瘤能力的影响提供依据。     

紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的烟草转化

将所克隆的紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因(TaGST)构建成植物表达载体pBI-TaGST,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38(Nicotiana tabacum cv.W38),获得了转基因的烟草植株.转基因植株的PCR和RT-PCR检测表明,该目的基因已经整合到烟草基因组上.     

东北红豆杉细胞GGPPS基因cDNA的克隆

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶是红豆杉细胞紫杉醇生物合成途径中的关键酶。试验采用RT-PCR技术从东北红豆杉中克隆GGPPS基因片段,将GGPPS基因片段与pMD20-Tvector连接,转化E.coli DH5α,对阳性克隆进行序列测定。生物信息学分析结果表明,获得GGPPS基因片段长度为371 bp,与GenBank中收录的GGPPS同源性达到99%。为从内生真菌紫杉醇生物合成途径中克隆关键酶基因和高产紫杉醇基因工程菌株的构建提供了借鉴。