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DNA改组(DNA shuffling)是一种高通量的突变、筛选技术,自1994年提出以来,经过了几十年的发展,其在DNA、酶和药物蛋白等的改造上都有突出的表现.腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV)是一种细小病毒,由于其无致病性和能有效呈递基因而成为一种非常理想的基因表达载体.但是AAV筛除存在一些不足,如对某些重要靶细胞感染效率不高、存在机体的免疫反应等限制了其临床研究的进展.应用DNA改组技术对AAV的衣壳蛋白进行定向进化,有望解决这些问题.本文重点综述DNA改组在AAV衣壳定向进化上的技术发展和应用,并结合本课题组在AAV衣壳DNA改组上的研究工作展开讨论. 相似文献
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靶向性是肿瘤基因治疗取得成功的关键因素. 在众多基因治疗病毒载体中, 腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是目前广为关注的基因治疗载体系统. AAV具有广泛的宿主范围, 这也导致其缺乏组织或细胞特异性, 对靶细胞的基因转染效率不高. 因此, 提高AAV载体在体内运输的靶向性和感染目的细胞的效率, 是实现AAV基因治疗的关键. 迄今为止, 科学家已开发出很多策略来改造腺相关病毒的外壳, 期望增强其靶向性或重靶向目的细胞. 这些策略不仅包括传统的化学修饰、噬菌体展示、外壳基因组改造和嵌合载体, 也包括新颖的标记营救、衣壳蛋白定向进化、AAV外壳直接肽段展示和AAVP (AAV-Phage)等. 本文评述了对AAV外壳改造达到靶向肿瘤细胞的研究进展. 相似文献
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重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体是能建立稳定表达的转导型表达载体,可用作基因治疗的外源基因荷载工具.与逆转录病毒相比,它具有高安全性、无致病性和能感染有丝分裂后细胞等的特点.目前重组AAV的制备,需要两种不同的重组AAV质粒,一种是含位于AAV基因组两端的为病毒复制和包装所必需的反向末端重复(Inverted ter-minal repeats,ITR)和外源基因的重组表达质粒载体;另一种质粒作为助手质粒,克隆了除两端ITR外的AAV全基因组DNA,它反式提供AAV复制和包装所需的病毒蛋白,当这两种质粒共转染宿主细胞时,如存在辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)的感染,就能包装出含外源基因的重组AAV假病毒颗粒. 相似文献
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与其他病毒载体相比, 腺相关病毒(adenovirus-associated virus, AAV)由于具有宿主范围广、病原性低和携带的治疗基因表达期长等优势而成为目前最有前景的基因转移载体之一. 然而, 在临床基因治疗过程中, AAV具有广泛的宿主范围同时也导致缺乏组织或细胞特异性, 对靶细胞的基因转染效率不高, 同时也缺乏安全性. 因此, 提高重组AAV (rAAV)的靶向能力对于基因治疗成功与否非常关键. 目前, 各种不同血清型AAVs的分离、鉴定、应用以及rAAV制备技术的发展使得rAAV载体可用于更多的临床基因治疗实验. 而且, 当前针对rAAV载体各种靶向策略的研究也显示了很好的基因治疗应用前景. 这些靶向策略主要包括转录靶向、受体靶向、共价偶联靶向、各种不同血清型AAV的应用以及基因重组靶向策略等. 本文就近年来基于rAAV载体的各种靶向策略的进展作一评述. 相似文献
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利用低温电镜术和像重构方法研究兔出血症病毒的 总被引:2,自引:0,他引:2
利用低温电镜术和像重构方法测定了兔出血症病毒的三维结构,分辨率达到3.2nm.兔出血症病毒的三维结构显示了杯状病毒的典型特征.位于二十面体二次轴和局域二次轴位置的90个弧状突起以及位于五和三次轴位置的32个杯状凹陷排布在T=3的二十面体衣壳上.因而从结构上表明中国株兔出血症病毒属于杯状病毒科.A,B壳粒之间相互连接,并且杯状凹陷底部未见隆起.兔出血症病毒衣壳壳层区由连续蛋白密度构成,未发现病毒RNA通道存在.从低温电镜像及三维密度图中可以分辨含基因组和含亚基因组两种病毒颗粒的存在.这两种病毒颗粒衣壳结构类似. 相似文献
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溴乙锭荧光探针法检测三链DNA的形成 总被引:1,自引:0,他引:1
早在1957年 Davis 等就曾报道过三链核酸的存在,但当时被认为是一种人为的没有生物学意义的结构而未引起人们的重视.直到1987年 Mirkin 等在酸性溶液的质粒中发现一种 H 型三链 DNA,同年 Dervan 等证实了可通过将第三股 DNA 粘接到含有真实基因的天然 DNA 上形成三链 DNA,才引起人们的广泛关注.目前已经发现,通过三链 DNA 的形成,寡聚核酸可以充当切割 DNA 的“分子剪刀”和提供抑制基因转录的新手段、并可能在发展治疗病毒性疾病(如爱滋病、癌症等)的新型药物等方面具有潜在的应用.鉴于这些原因,发展一种灵敏度较高的有效检测三链 DNA 形成的方法是十分有意义的.溴乙锭(以下 相似文献
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利用低温电镜订和像重构方法测定了兔出血症病毒的三维结构,分辨率达到3.2nm,兔出血症病毒的三维结构显示了杯状病毒的典型特征。位于二十面体二次轴和局域二次轴位置的90个弧状突起以及位于五和三次轴位置的32个杯状凹陷排布在T=3的二十面体衣壳上。因而从结构上表明中国株兔出血症病毒属于杯状病毒科,A,B壳粒之间相互连接,并且杯状凹陷底部未见隆起。兔出血症病毒衣壳壳层区由连续蛋白密度构成,未发现病毒RNA通道存在。从低温电镜像及三维密度图中可以分辨含基因组和含亚基因组两种病毒颗粒的存在。这两种病毒颗粒衣壳结构类似。 相似文献
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大麦黄矮病毒介体麦二叉蚜和麦长管蚜体内传毒相关蛋白的确定 总被引:4,自引:0,他引:4
应用双向电泳和病毒覆盖测定技术, 从大麦黄矮病毒麦二叉蚜和麦长管蚜株系(GAV)的传毒介体麦二叉蚜和麦长管蚜的蛋白质提取物中检测到一种分子量为50 kD的蛋白(P50), 它与提纯的病毒有高的亲和反应. 对麦二叉蚜体内的P50进行了电泳分离并制备了家兔抗血清, 两种麦蚜饲食该蛋白的抗血清后, 传毒效率分别由对照的72.55%和73.44%下降为8.57%和28.56%, 表明该蛋白是参与病毒与介体麦蚜相互识别的传毒相关蛋白. 采用电子显微镜免疫胶体金对50 kD传毒相关蛋白进行麦蚜体内定位, 发现其存在于麦二叉蚜的头部唾液腺组织中, 揭示出麦蚜唾液附腺组织上的膜蛋白与病毒的相互识别是麦蚜能够传播大麦黄矮病毒的根本原因. 相似文献
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外源或内源的DNA损伤在生物体内持续发生。DNA损伤修复的缺陷与很多疾病甚至癌症等息息相关,而生物细胞进化出一系列精密的修复机制以耐受或切除这些损伤。单分子技术区别于常规的生化、分子生物学等手段,可以在体外和活细胞内研究DNA修复相关生物分子的动态反应特征,从而对DNA修复机制进行更充分的剖析。文章围绕常见的DNA损伤及其修复类型,阐述了近年来利用原子力显微镜、磁镊、光镊等单分子操控技术,以及全内反射荧光显微镜、光激活定位显微镜和超分辨显微示踪等单分子荧光成像技术在DNA修复机制研究中取得的进展,梳理了利用单分子技术解决的长期存在的关于DNA修复难题,并展望了单分子技术联合其他交叉学科技术在研究DNA修复机制方面的前景。 相似文献
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新生命究竟"新"在哪里?经典的遗传学观念认为基因决定表型,但同卵双生的双胞胎基因几乎完全相同,为何依然存在很大差别?越来越多的研究证实,代际间的表观遗传改变决定了我们生而不同。表观遗传学是指独立于DNA序列改变的遗传,主要包含DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等。本文生动形象地介绍了表观遗传的概念及核心内容,重点描绘了表观遗传修饰(包括DNA甲基化和组蛋白修饰)在早期胚胎发育过程中的动态变化,有助于我们深入理解表观遗传在新生命发生过程中的作用。 相似文献
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进化是生命多样性形成的重要动力和基础。1993年,阿诺德首次引入酶定向进化技术,而该技术制备出的酶在生物燃料和药品制备等方面均得到广泛应用。1985年,史密斯首次实现在噬菌体表面表达外源蛋白的噬菌体展示技术;1990年,温特首次将噬菌体展示技术用于抗体制备。噬菌体展示技术制备的阿达木人单抗于2002年批准应用于多种免疫性疾病的治疗。因此,酶定向进化和抗体噬菌体展示已为人类带来巨大利益,并为将来的化学革命奠定了坚实基础。阿诺德、史密斯和温特三位科学家由于这些奠基性贡献而分享2018年诺贝尔化学奖。文章介绍这些技术的发明过程和广泛应用,同时回顾多位科学家的重要贡献。 相似文献
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古代DNA 技术及其在家养动物驯化历史研究中的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
家养动物始终伴随着人类文明的发生、发展, 其起源和驯化历史一直备受关注. 而在其 近万年的演化历史中, 家养和野生群体间可能发生基因互渗及替代, 因此基于现代物种DNA 信息进行的历史推断可能存在偏差. 近年来, 古代生物遗骸中的DNA (古代DNA)获取技术日 益成熟, 为这类研究开辟了新的途径. 本文总结了近年来古代DNA 技术研究进展, 点评了古 代生物遗骸DNA 的获取和鉴别方法、古代DNA 提取、扩增及测序技术的革新. 最后, 本文综 述了古代DNA 技术在猪、马、羊、狗等主要家养动物驯化历史研究中的应用进展, 为该技术 的进一步发展及应用提供有益的参考. 相似文献
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锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶 总被引:1,自引:0,他引:1
该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因动物或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokⅠ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%;而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2%,较常规基因打靶定点整合率(10-6~10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为动物定点转基因和人类基因治疗提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景. 相似文献
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