血红素丙酸基甲酯化的细胞色素b5及其F58位突变体蛋白的研究

为了进一步认识Phe58与血红素b之间芳环堆砌相互作用对蛋白质结构稳定性和性质影响的本质, 我们将Cyt b₅和它的突变体F58Y, F58W蛋白的血红素丙酸根进行了甲酯化, 考察丙酸根参与的氢键网络是否对Phe58与血红素的π-π相互作用有影响. 各种谱学和反应的研究表明, 野生型及58位突变体蛋白甲酯化后, 58位芳环与周围芳环之间的堆积作用仍然存在, 但由于替代氨基酸残基的体积、疏水性及形成氢键能力等方面性质不同, 对蛋白的稳定性产生了一定的影响.     

细胞色素b5若干表面荷负电残基突变体蛋白的制备及初步表征

用寡聚核苷酸诱导定点突变方法，将细胞色素b5血红素暴露边周围的负电荷残基用疏水性丙氨酸残基取代，得到7种双方和多点突变的细胞色素 b5蛋白，基因碱基序列测定以及蛋白质分子量测定结果都表明突变正确，突变体蛋白的光谱电化学研究结果表明，它们的表观还原电位发生了2－10mV的正向移动，突变体蛋白的整体结构没有明显变化，为进一步研究蛋白表面电荷的作用奠定了基础。     

相转移催化条件下双氰胺取代反应的研究

双氰胺(dicyandiamide)又称氰基胍(cyanoglmnjdine),是合成新型材料如密胺塑料和药物如巴比土酸盐和胍基衍生物等的主要原料,应用十分广泛。然而,关于双氰胺的取代反应,特别是四取代反应的研究工作还未见报道。我们在此报道在相转移催化条件下双氰胺取代反应的研究工作。 在一般条件下双氰胺很难发生四取代反应,Suyama等曾尝试用非直接烷基化的方法来制取双氰胺的四取代产物,但未获成功,这也是至今未见报道的原因之一。我们认为,双氰胺进行四取代反应的困难在于其发生取代反应后增加了取代基与氰亚氨基的立体位阻效应,阻碍了进一步的反应。我们尝试使用相转移催化剂来克服上述困难。实验结果表明,相转移催化剂对于这一反应具有异常的活性。在碱的水溶液-甲苯中加入相转移催化剂(如四丁基溴化铵、三乙基苄基氯化铵TEBA等),双氰胺与卤代物(RX)可顺利地进行烷基化反应,得到很好的结果。     

胍变性的OPTA标记的肌酸激酶的再折叠研究

变性的完整蛋白质分子在体外再折叠的研究虽然不能完全模拟体内新生肽链的折叠,然而它可以对蛋白质的折叠提供一些有用的信息.因此近年来对于变性蛋白质再折叠的研究引起了人们广泛的重视.过去我们曾经研究了经脲或盐酸胍变性的肌酸激酶的再折叠与复活,发现在适当的条件下,变性的肌酸激酶可以再折叠至接近天然构象状态,酶活力亦可恢复至接近初始酶活力.比较再折叠与复活的动力学过程,发现酶分子再折叠和复活不是同步进行,在再折叠基本完成之后,酶的复活尚有一个很长的慢过程.我们曾用OPTA专一性的标记酶的活性部位,形成一个荧光基团,以此为探针探测在低浓度脲溶液中失活时活性部位的构象变化.在本文中,我们用这个荧光探针,探测了在胍变性肌酸激酶再折叠过程中,酶的活性部位的构象变化过程,并与整个分子的再折叠和酶的复活过程进行了比较研究.     

人类β珠蛋白基因HBB及其突变体的mRNA-蛋白质二级结构分析

SNPs能改变基因表达,导致编码氨基酸突变,影响蛋白质功能,这是目前被密切关注的问题.对此,普遍认为蛋白质结构的变化源自氨基酸取代,很少有人注意mRNA结构变化的影响.选取人类??珠蛋白基因HBB及其4个突变体样本,用动态延伸折叠方法构建mRNA二级结构,从有关数据库获得它们的表达产物的二级结构.分别对成熟mRNA和蛋白质做突变前后的结构对比,并进行mRNA-蛋白质相应结构变化的对照.结果发现,蛋白质中规则构象一般为mRNA中的稳定区域编码,而不规则构象(?/?转角、卷曲)为mRNA中的不稳定区域编码.不稳定区域内的碱基突变引起mRNA二级结构的变化,将会在蛋白质结构中留下"变化印迹".这种mRNA二级结构和编码蛋白质二级结构的相关性可能作为探寻蛋白质功能变化的一种谋略.     

四唑及其衍生物的理论研究——Ⅰ.氯代四唑的从头算

用从头算方法,取6-311G基组分别在HF和MP2水平上,计算研究了1H和2H四唑的4种一氯取代物的全优化几何构型和电子结构。4个化合物均取平面构型;环骨架键长趋于平均化,均具芳香性(Ⅱ_5~6)。与1—Cl和2—Cl四唑相比,5—Cl四唑将具较强的酸性,分子总能量也较低,其中5-Cl-2H-四唑分子总能量最低、最稳定。     

蛋白质超家族分子进化研究的一种新方法

选取丝氨酸蛋白酶超家族作为研究对象，采用ＳＳＡＰ算法从结构比较的层次上进行蛋白质超家庭分子进行化的研究，分子相同或相似物中酶和功能的演化，鼠类胰鼠白酶突变体结构的聚类关系以及不同抑制对牛β－胰蛋白酶天然结构的影响，探索了结构比较对于蛋白质工程中定点突变改造蛋白质结构与细胞以及蛋白质抑制剂设计等方面的指导作用，基于结构比较的方法是蛋白分子进化的一种新方法。     

衣藻细胞色素b559 α 亚基Ser24残基定点突变影响PSⅡ光合放氧活性

为研究细胞色素b₅₅₉ (Cyt b₅₅₉)在光合系统中的功能, 采用大引物定点突变技术, 将衣藻叶绿体Cyt b₅₅₉ α亚基(psbE基因编码)中与组氨酸(His²³)相邻的氨基酸残基丝氨酸(Ser²⁴)定点突变为苯丙氨酸(Phe), 获得突变体S24F. 对突变体的生理生化分析表明, S24F既能进行光合自养也能进行光合异养, 但是在自养和异养条件下, 其生长速率比对照慢; S24F的PSⅡ放氧活性约为野生衣藻细胞的71%, S24F的光系统Ⅱ(PSⅡ)光化学效率F_v/F_m比野生型对照低约0.23. 此外, 相比野生型对照, 突变体S24F对强光更加敏感; SDS-PAGE和Western杂交的结果表明, 对Cyt b₅₅₉ α亚基中Ser²⁴的定点突变影响了Cyt b₅₅₉ α亚基及其他膜蛋白, 如LHCⅡ和PsbO等的表达. 上述结果说明, 虽然Ser²⁴残基并不参与血红素配位, 但其对维持PSⅡ的活性具有重要作用.     

细胞色素b5与细胞色素c的结合

生物大分子之间的结合和识别是生命活动中最基本的过程,研究细胞色素b_5和细胞色素c的结合,有助于认识生物大分子之间的相互作用和生物体中的长程电子转移反应.Mauk等人利用紫外可见差谱研究了细胞色素b_5和细胞色素c之间的相互作用,发现两者形成1:1的蛋白络络合物.计算机模拟结果表明牛肝细胞色素b_5和酵母iso-1-细胞色素c有两种主要的结合方式:一种是细胞色素b_5上的Glu44,Glu48,Asp60和血红素b上的丙酸根依次与细胞色素c上的Lys27,Arg13,Tml 72(trimethyllysine)和Lys79形成盐键;另外一种结合方式是细胞色素b_5上的Glu48,Glu56,Asp60和血红素b丙酸根与细胞色素c上的Arg13(或者Lys 13),Lys 87,Lys 86和Tml 72形成盐键.Rodgers和Sligar用高压法结合定点突变技术研究了牛肝细胞色素b_5和马心细胞色素c之间的结合,证明细胞色素b_5是通过第一种方式与细胞色素c结合,而Glu56并没有参与蛋白间的结合.     

Y14F天花粉蛋白的晶体结构研究

核糖体失活蛋白（Ribosome inactivating protein,RIP）是广泛存在于植物界的蛋白毒素,天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）又是该家族中的一个重要成员。TCS及其同源蛋白的高分辨率晶体结构为进行结构与功能关系的研究打下了良好的基础,通过对同源蛋白的结构比较发现在结构中存在着很保守的氢键。为了探讨这些保守氢键对结构与功能的影响,我们用基因定位突变的方法,对形成保守氢键的残基进行突变,测定这些突变体的活性与晶体结构,可以加深我们对这些保守氢键所起作用的认识。TCS中Tyr14的羟基与Ser157的主链氧之间形成保守氢键,这一氢键在螺旋α5的弯折处,而且Ser157的主链碳基氧明显偏离了正常螺旋中的与螺旋轴平行的方向,这一现象在已知的RIPs结构中都存在。为了考察这一保守氢键对螺旋α5弯折的形成所起的作用,我们将Tyr14突变为Phe,这样突变后将保留芳香环侧链的特性,突变后的构象变化主要来自这一保守氢键的消失,以便于考察这一保守氢键对螺旋     

四唑及其衍生物的理论研究——Ⅰ.氯代四唑的从头算

用从头算方法，取６－３１１Ｇ基组分别在ＨＦ和ＭＰ２水平上，计算研究了１Ｈ和２Ｈ四唑的４种一氯取代物的全优化几何构型和电子结构，４个化合物均取平面构型；环骨架键长趋于平均化，均具芳香性（П＾６５）与１－Ｃｌ与２－Ｃｌ四唑相比，５－Ｃｌ四唑将具较强的酸性，分子总能量也较低，其中５－Ｃｌ－２Ｈ－四唑分子总能量最低，最稳定。     

植物环蛋白的薄层层析显色反应

用碘、碘化铋钾、茚三酮和考马斯亮蓝G-250四种显色剂对包括植物环蛋白在内的3种寡肽以及氨基酸和蛋白质在薄层层析板上进行了5组显色反应研究. 结果表明, 可以综合考马斯亮蓝G-250和水解前后对茚三酮的显色来识别环蛋白. 应用该显色方法开展了三色堇、紫花地丁、如意草、木鳖子和苦瓜等5种植物的环蛋白的检测和纯化工作, 均检测出环蛋白, 并分离获得十多个环蛋白, 鉴定了其中的3个, 为已知环蛋白cycloviolacin O2, kalata B1和vary peptide A.     

SGK和14-3-3蛋白与TPO/MPL信号传导的丝氨酸/苏氨酸磷酸化机制有关

血小板生成素(thrombopoietin, TPO)是调节血小板生成最主要的细胞因子, 它的生物学效应由其受体c-Mpl介导. 用酵母双杂合系统(two-hybrid system)筛选了与c-Mpl膜内部分相互作用的蛋白质. 在5×106个转化子中, 得到48个阳性克隆. 测序结果表明, 其中一个是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SGK (serum and glucocorticoid-inducible kinase)的部分编码序列(编码第246位氨基酸至C末端, 包括3′端非编码区); 另一个为14-3-3 theta亚型蛋白的部分编码序列(编码第67位氨基酸至C末端, 包括3′端非编码区). 体外GST-Pulldown分析和免疫共沉淀进一步证实了c-Mpl与它们的相互作用. 通过系列缺失研究发现两个蛋白与c-Mpl相互作用的区域都在523~554 aa范围内. 用酵母双杂合系统进一步研究SGK和14-3-3蛋白之间的关系, 发现两者可能直接相互作用. SGK和14-3-3蛋白可能与TPO/MPL信号传导过程中的丝氨酸/苏氨酸磷酸化有关.     

水稻线粒体tRNATrp的种属特异性氨酰化

为了研究原核生物和真核生物（细胞质）色氨酰tRNA合成酶（TrpRS）对线粒体tRNA^Trp识别的种属特异性，构建了7个水稻线粒体tRNA^Trp三位点（G73，U72，A68）的单点或多点突变的突变体．这些突变基因，经体外转录后分别用枯草杆菌（B．subtilis）和人色氨酰tRNA合成酶（TrpRS）进行氨酰化反应，并测定它们的动力学常数．结果表明，与野生型水稻线粒体tRNA^Trp相比，7个突变体的转录产物被B．subtilis TrpRS氨酰化的活力分别降低了53．33％-99．79％，被人TrpRS氨酰化的活力却分别提高了4～330倍，其中以MPH7（水稻线粒体tRNA^Trp的三碱基（G73，U72和C68）全部突变为人tRNA^Trp的三碱基序列）的氨酰化活力改变最大．实验结果证明，与真核生物和原核生物细胞质tRNATrp的种族特异性类似，水稻线粒体tRNA^Trp的种属特异性元件也主要处于氨基酸接受茎的识别位碱基、第一和第五对碱基对，亦即识别位碱基G73，氨基酸接受茎上的两个碱基对G1／U72和U5／A68．本研究为线粒体tRNA^Trp起源于真细菌的推论提供了实验依据．     

褐飞虱诱导的水稻RH3基因的克隆及其表达特性

组蛋白H3基因的表达与个体发育、细胞组织特异性以及胁迫反应等相关. 在褐飞虱取食后的水稻cDNA差减文库中筛选到编码水稻组蛋白H3(RH3)的EST(GenBank登录号: BU572343), 以该EST为探针, 从褐飞虱取食后的水稻cDNA文库中分离到RH3基因的全长cDNA. 该基因编码一个含136个氨基酸残基的H3蛋白, 与以前克隆出的一种抗病相关蛋白基因(GenBank登录号: AF467728)只有1个碱基的差异, 蛋白质的氨基酸序列第126位上由赖氨酸取代了天冬氨酸. 应用Northern blot技术, 研究了褐飞虱取食后不同时间段水稻RH3基因的表达水平, 同时分析了植物激素、干旱、盐胁迫及机械损伤等因素对其转录水平的影响. 结果表明, 褐飞虱取食8 h后RH3基因表达开始增强, 96 h后达到峰值. 干旱处理和稻瘟病菌接种能诱导RH3基因的表达增强, 而脱落酸处理则对该基因的表达起负调控作用. 利用RNA原位杂交技术, 对接种褐飞虱48 h后水稻的茎叶切片进行了RH3 mRNA的原位定位. 结果显示, 在褐飞虱取食后, RH3基因的转录本在维管束及短细胞中的积累尤其明显. 水稻组蛋白H3基因的表达与水稻对褐飞虱的应激反应相关.     

人类肽-甲硫氨酸亚砜还原酶的cDNA克隆、组织表达谱特征及染色体定位

蛋白质结构中某些氨基酸的氧化和还原是生物体内对蛋白功能的一种调控方式．甲硫氨酸（Ｍｅｔ）被氧化则变为甲硫氨酸亚砜（Ｍｅｔ（Ｏ）），它可导致所在蛋白质的生物学活性降低或丧失，但肽－甲硫氨酸亚砚还原酶（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ， ｍｓｒＡ）则可使甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸，使其所在蛋白质重新恢复活性．为了研究人体中Ｍｅｔ氧化还原的机制，以牛ｍｓｒＡ ｃＤＮＡ序列为信息探针，筛选人ＥＳＴ数据库，依据若干同源ＥＳＴ的信息从人ｃＤＮＡ分子库中克隆到一个长１２５５ｈｐ的人ＭＳＲＡ ｃＤＮＡ．该ＣＤＮＡ包含一个长７０５ ｂｐ的可读框，它编码了 ２３５个氨基酸残基．同源性比较表明，该基因与牛和大肠杆菌的ｍｓｒＡ基因的氨基酸一致性分别为８８％和６１％．表达谱分析发现，该基因在人体大多数组织中均有一条长约１．６ｋｂ的转录本，并在肾中呈高表达．应用辐射杂种细胞株定位系统（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｐａｎｅｌ， ＲＨ ｍａｐｐｉｎｇ）将该基因精确定位在人染色体８ｐ２２～２３区带的ＤＳＳ５１８和Ｄ８５５５０位标之间，由于此前已有Ｋｅｒａｔｏｌｙｔｉｃｗｉｎｔｅｒｅｒｙｔｈ     

双亲金属卟啉跨膜转移的控制

利用双亲原卟啉Ｐ１及其金属锌络合卟啉Ｐ１Ｚｎ亲水基团（对位取代的苯酚基）的去质子化，来增强这类分的亲水能力，用敏感于微环境变化的ＵＶ－Ｖｉｓ光谱，研究了ＣＴＡＢ胶束中卟啉所处微环境对体相ＰＨ值或体相盐浓度变化的依赖关系，随着体相ＰＨ值的增另，Ｐ１Ｚｎ和Ｐ１的Ｓｏｒｅｔ带红移，吸光度减小，半峰宽加大，是卟啉从ＣＴＡＢ胶束内核转移到胶束表面的结果；在Ｐ１Ｚｎ和Ｐ１的Ｓｏｒｅｔ带ＰＨ敏感区，增加体相的盐     

用脉冲辐解法研究藻胆蛋白与羟自由基反应动力学

用竞争反应动力学方法研究，３种藻胆蛋白对羟基自由基的清除作用，其中Ｃ－藻蓝蛋白（Ｃ－ＰＣ）和变藻蓝蛋白（ＡＰＣ）从螺旋藻（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）中提取； Ｒ－藻红蛋白（Ｒ－ＰＥ）从多管藻（Ｐｏｌｙｓｉｐｈｏｎｉａ ｕｒｃｅｏｌａｔａ）中提取；羟基自由基通过脉冲辐解水产生．实验结果表明， ３种藻胆蛋白对羟自由基有强的清除作用；测量得到清除反应速率常数在（２．８～５．６）×１０~９Ｌ·ｍｏｌ~（－１）·ｓ~（－１）之间。     

系列氰化物与双卤分子间卤键的结构和性质

在MP2/aug-cc-pVDZ理论水平上对一系列卤键复合物R-C≡N...BrY(R=F,Cl,Br,C≡CH,CH==CH2,CH3,C2H5;Y=F,Cl,Br)进行了系统的理论研究,采用量子化学从头算、电子密度拓扑分析方法,从分子静电势、复合物的稳定构型、振动频率、电子密度拓扑性质等方面,探讨了卤键作用的本质和性质特征.研究表明,RCN与BrY之间形成n型卤键,属于闭壳层静电相互作用.复合物与单体相比,电子受体Br-Y键的键长增加,振动频率红移.氰化物上取代基的诱导效应对复合物的几何构型、卤键强度、电子密度拓扑性质和原子积分性质等都产生显著影响.分子静电势与卤键强度、键鞍点处电子密度拓扑参数值(ρ(rc),▽2ρ(rc),Gc,Hc,-Gc/Vc)等密切相关.在卤键复合物形成过程中,电荷从RCN向BrY转移,BrY总积分净电荷减小,溴原子能量降低,溴原子偶极矩和原子体积均变小.     

硅酞菁染料与SiO2介质的结构关联及强光限幅效应

通过二氯硅酞菁染料（ＳｉＰｃＣ１２）中的活性氯与γ－氨基丙基三乙氧基硅烷（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅ－ｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ，ＮＨ_２（ＣＨ_２）_３Ｓｉ（ＯＣ_２Ｈ_５）_３，ＫＨ５５０）中氨基的亲核取代化学反应，把硅酞菁染料连接到ＫＨ５５０中．反应产物与γ－缩水甘油醚基丙基三甲氧基硅烷（３－ｇｌｙｃｉｄｏｘｙｐｒｏｐｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ，ＣＨ_２ＯＣＨＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２）_３Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３，ＫＨ５６０）相复合，随着系统物质的水解和聚合反应的进行，ＳｉＰｃ成功地嫁接于无机网络中，使得本来极难溶的酞菁有机分子以较大浓度以单体形式掺杂到无机介质中，制得较好物化性能与光学性能的复合材料．用红外光谱与紫外光谱表征了ＳｉＰｃＣ１_２与ＫＨ５５０的化学反应产物用波长５３２ｎｍ，脉宽８ｎｓ的 Ｎｄ~(３＋)． ＹＡＧ激光对获得的不同 ＳｉＰｃＣｌ_２掺杂浓度的复合材料的光限幅效应作了研究．