豌豆EF-1α的cDNA克隆、全序列及结构特征分析

以赤霉素 (GA)处理后的G2豌豆为材料 ,构建了一个 2 .0× 1 0 6的cDNA文库 ,用随机筛选法从该文库中得到一个 1 6 6 7bp的cDNA ,其 5′端非编码区长 1 0 0bp ,3′端非编码区长 2 2 3bp ,拥有一个 1 34 4bp的开放读码框 ,共编码 447个氨基酸 .DNA及报道的蛋白质序列同源性分析表明 ,它编码了豌豆延伸因子 1α(elongationfactor 1 alpha ,EF 1α) ,其功能区段具有很高的保守性 ,可应用于分子进化研究     

白芷细胞外ECBP21全长cDNA克隆

ECBP21是从白芷悬浮培养细胞外检测并纯化的一种依赖钙的钙调素结合蛋白。利用RT－PCR和5‘-RACE方法，获得其cDNA全长。ECBP21 cDNA全长947bp，编码216个氨基酸，其中N端1－25氨基酸为信号肽，26－216氨基酸为成熟蛋白肽段，而且26－45氨基酸序列与纯化ECBP21N末端测序结果完全一致。将此cDNA成熟蛋白编码区核苷酸片段导入pET-28b( )表达载体中，并在大肠杆菌表达系统中诱导表达，经CaM-Gel overlay检测证实表达蛋白具有Ca^2 依赖的钙调素结合特征，从而进一步证实了cDNA克隆的正确性。这为进一步用分子生物学方法研究植物细胞外多肽ECBP21的生物学功能奠定了基础。     

一个新的人类硫氧化还原蛋白基因的克隆

根据不同发育阶段 ( 1 3,33周 )的人胎脑组织mRNA差异显示分析 (又称DDRT PCR)所得到的具有差异表达的EST的序列 ,设计引物筛选点阵排列的人胎脑cDNA文库 ,得到一个新的全长cDNA克隆 .这个克隆全长 1 2 0 8bp ,包含一个 889bp的开放阅读框 ,一个 1 32bp的 5′非翻译序列和一个 2 0 9bp的 3′非翻译序列以及典型的polyA加尾信号 .其推断的氨基酸序列与人硫氧化还原蛋白同源 ,而且含有硫氧化还原蛋白的保守的活性位点序列 .将它命名为人的类硫氧化还原蛋白基因 (humanthioredoxinlikegene ,hTRXL) .     

一个编码玉米转译起始因子新基因的克隆

采用DD PCR方法比较玉米杂种一代及其亲本苗期基因表达产物mRNA的差异 ,分离并鉴定出一个玉米杂种一代超亲表达的cDNA .以该cDNA为探针从cDNA文库中筛选到一个全长的cDNA克隆 (ZH0 1) .ZH0 1长 1780bp ,5′端非编码区 112bp ,3′端非编码区 395bp ,开放阅读框共编码 4 14个氨基酸 .序列同源比较表明 ,ZH0 1为一个亲的玉米转译起始因子eIF4A基因家族成员 .     

利用cDNA微阵列技术筛选和鉴定NYD-SP9基因

运用cDNA微阵列杂交技术从人睾丸cDNA文库中筛选出人蛋白激酶基因，命名为NYD－SP9，NYD－SP9在成人睾丸中表达水平比胚胎睾丸高10倍，Southern印迹杂交结果表明，这一基因高表达于睾丸，而低表达于卵巢，cDNA序列的蛋白质基序磷酸化位点分析也进一步提示，它有可能参与精子发生中的信号转导过程，由于这些磷酸化位点的位置彼此很接受，在这些位点之间可能存在相互作用以调控精子发生，该基因含有一个保守的穿膜功能结构域，提示经翻译后为一跨膜蛋白，以上实验结果表明，蛋白激酶基因NYD－SP9可能在男性生殖细胞分化过程中发挥一定作用。     

水分胁迫诱导表达的小麦基因的cDNA片段克隆和序列分析

以30％（-1.13 MPa）PEG-6000对小麦幼苗进行重度水分胁迫处理,利用mRNA差异显示技术分离了水分胁迫诱导表达的小麦基因dil（dehydration induced,dil）的cDNA片段。Northern blot分析表明,dil基因在水分胁迫10h后表达开始增强并随着水分胁迫时间的延长而增强,水分胁迫48h时其表达最强。对dil基因的cDNA片段进行了克隆和序列测定（211bp）。经查询,在GenBank中没有与dil同源的基因序列。     

水稻全生育期均一化cDNA文库的构建和鉴定

以优良杂交水稻的恢复系明恢63为材料，构建覆盖水稻基因组的cDNA文库，用于功能基因组的研究。选择水稻全生育期过程的9个时期的不同组织和病原诱导的组织分别构建了15个定向cDNA文库。依据基因组DNA饱和杂交的原理，将从15个独立的cDNA文库中提取的质粒混合，并与固定有磁珠上具有互补性的2份基因组DNA亲和体系饱和杂交，收集杂交组分中的质粒并重新转化大肠杆菌，获得全生育期均一化cDNA文库。该文库平均插入片段1.4kb，含62000个克隆子。反向Northem杂交显示，该文库收集了众多表达丰度极低的基因以及特异表达的基因。对文库中随机的10750个克隆进行了测序，序列分析比较后获得6399条非重复的EST(expressed sequence tag)序列，非重复序列占59.5％。目前，用该文库制作的cDNA芯片已被用于功能基因组的研究。     

春化相关基因ver203FcDNA3′末端的克隆及序列分析

以差异筛选技术克隆到的春化相关基因cDNAverc2 0 3为基础 ,设计 5′端引物 ,利用RACE克隆策略 ,通过RT PCR扩增得到cDNA的 3′未端序列ver2 0 3F(1197bp) .Northernblot分析表明其全长约为 2 .0kb ,且其表达具有春化处理的特异性 .检索表明该基因序列(AB0 12 10 3)与一大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性 .推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径 .     

一个与人鼻咽癌相关新基因的克隆

利用高密度ｃＤＮＡ微阵列表达检测技术，筛选出在成人正常鼻咽组织高表达而在成人咎咽低分化鳞状细胞癌组织中低表达的ＥＳＴＮ２７７４１，用ＲＴ－ＰＣＲ技术证实之，进而由该ＥＳＴ克隆出长度为１０９６ｂｐ的新基因，利用生物信息学分析发现，该序列有含有完整的阅读横架，编码２５６个氨基酸，在５＇端起始密友子上游有终止密友子ＴＡＡ，３＇端有加尾信号ＡＡＴＡＡＡ和ｐｏｌｙ Ａ尾，该新序列在非宙余的核酸序列数据 比     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离及其启动子功能分析

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

一个猪免疫球蛋白IgG H链基因的克隆、序列分析及表达

用RT PCR方法从猪脾脏中分离到一段 1 42 5bp的DNA片段 ,该片段编码免疫球蛋白基因 .经全序列分析证明此片段与前人报道的序列有较高同源性 ,其C区属于猪Igγ链基因亚类 3.用EcoRⅠ和NsiⅠ切点将该片段切下插入pET 3b(NSEB) ( - )中 ,表达出约 5 2ku的蛋白质 ,表达量约为 2 1 % .     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

伪狂犬病毒胸苷激酶基因变异引起的病毒致弱作用

为揭示PRV tk基因结构与毒力的相互关系，tk基因结构变异对病毒生物学特性的影响和探讨病毒的致弱机理，以伪狂犬病毒湖北株（PRV HB）为材料，用BUdB诱变选择，分离出BUdR抗性的PRV TK^-突变株。在对野毒株和TK^-突变株tk基因克隆和测序的基础上，分析比较了两种毒株tk基因的一级结构。测定的PRV HB野毒株tk基因片段长1587bp，GC含量为72．7％。包含一个1098bp的ORF。编码366个氨基酸残基组成的蛋白。ORF内有2个137bp核苷酸的重复序列，两者以一个A连接。测定的TK^-突变株tk基因片段长1458bp，野毒株中137bp重复序列之一和连接A被自然删除，另有一个8核苷酸（GCGCGCCC）重复片段的插入，其他所有核苷酸与野毒株一致。在TK^-突变株中因核苷酸片段的缺失和插入，tk基因发生移框突变，导致转译提前终止，不能产生有功能的TK蛋白。氨基酸序列分析显示，PRV HB TK具有疱疹病毒TK共有的保守功能区并多出一个保守的DRH功能位点。实验还证实，TK^-突变株具有生物学遗传稳定性。与野毒株比较，其毒力显著降低。用TK^-突变株种小鼠，能诱导小鼠产生针对PRV强毒株致死攻击的有效保护。     

胡萝卜根特异表达水通道蛋白基因DcRB7的分离

从胡萝卜胚cDNA文库中分离得到一条完整的cDNA片段, 序列分析表明属于水通道家族新成员, 并与烟草根特异性表达TobRB7基因高度同源, 因此命名为DcRB7. Northern杂交分析表明DcRB7在根中特异性表达. 利用反向PCR技术, 分离获得了DcRB7基因上游约650 bp的片段. 将此片段与含有GUS报告基因表达载体进行重组构建后, 以农杆菌介导转化烟草获得相应的转基因植株. 在对转基因烟草的GUS表达特性进行了组织化学鉴定和荧光定量分析后发现, 该调控区段能指导GUS基因在烟草根中优势表达, 并表现出干旱诱导的特性.     

棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆

采用功能筛选策略从以PVX病毒载体建立的棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae) cDNA文库中克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段). 以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA文库, 采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana), 从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆. 对上述阳性克隆进行序列测定和分析, 结果显示, 其中7个与已知的基因具有较高的同源性, 其中PBC43编码一个特异的elicitin蛋白; PBC163编码一个Rab蛋白, 与大豆疫霉的RAB同源性较高; PBC241编码抗增殖蛋白(prohibitin); PBN62编码一个热激蛋白60 (HSP60). 还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因, 提示可能是该病原菌特异的激发子基因. 上述结果表明, 利用病毒表达载体构建cDNA文库, 用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生过敏反应的激发子基因, 该方法可望为其他植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台.     

水稻花药发育相关基因OsPRP1的克隆和特性分析

利用减法杂交和RACEs从水稻颖花中克隆了一个编码富含脯氨酸残基多肽的cDNA, 并将其相应的基因命名为OsPRP1. OsPRP1由2个外显子和1内含子组成, 编码的蛋白由224个氨基酸残基组成, 其中脯氨酸含量最高, 占14.29%. 该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽, 一个N-端结构域和一个C-端结构域组成. C-端含有2个18个氨基酸长的、嵌合PEPK基元(motif)的富含脯氨酸的重复序列. Southern blot及序列分析结果表明, 水稻基因组中存在4个拷贝的OsPRP1, 它们定位在第10染色体的20 kb的DNA片段上. RT-PCR表明, OsPRP1在幼芽和颖花中表达量较高, 在根和叶中有少量表达. 用花和幼芽进行原位杂交分析证明在花中, OsPRP1在花粉母细胞、绒毡层细胞和花器官的维管束细胞中表达; 该基因的表达有明显的时间特异性, 在花粉母细胞中表达量最高, 在单核期的小孢子中几乎不表达; 在芽中, 该基因在胚芽鞘和叶原基的表皮细胞中表达. 从该基因编码蛋白的特点可以看出它极可能是一种细胞壁蛋白.     

水稻减数分裂相关基因OsDMC1的克隆

酵母DMC1基因是一个在减数分裂前期Ⅰ表达的减数分裂特异基因，其产物是减数分裂同源染色体配对所必需的，根据在酵母Dmc1与拟南芥AtDmcl中保守的氨基酸motifs合成的简并性引物，以cDNA作模板，通过套式PCR（nested PCR）和RACEs克隆了水稻中酵母DMC1的同源基因OsDMC1，OsDMC1全长的cDNA是1348bp，编码344个氨基酸组成的多肽（OsDmcl），OsDmcl与Dmcl和AtDmcl的氨基酸序列一致性分别是51．8％和81．7％，OsMDC1在生殖器官中表达量较高，在根中有少量表达，而在叶和幼芽中不表达，Southern blot分析结果表明水稻基因组中有两个拷贝的OsDMC1。     

水稻紫黄质脱环氧化酶基因的克隆、体外表达及酶促反应

从水稻中克隆了紫黄质脱环氧化酶（VDE）基因，其全长cDNA序列为1887bp，编码446个氨基酸，其中转运肽长98个氨基酸，构建了该基因的原核表达载体pET-Rvde，在0.4mmol/L IPTG的诱导下，外源蛋白大量表达，其分子量与天然的VDE蛋白一致，表达量随诱导时间而增加。Western杂交表明表达蛋白与VDE的多克隆抗体有免疫反应，将表达蛋白用于紫黄质的脱环氧化反应，吸收光谱及HPLC分析结果表明，表达蛋白能在体外催化紫黄质转变成为玉米黄质和环氧玉米黄质。     

水稻肉桂酰辅酶A还原酶基因的克隆与表达分析

用现有的OsCCR 基因片段筛选水稻核DNA文库, 获得了长为3045 bp的核DNA. 它包含4个内含子和5 个外显子, 推测的可读框长为337个氨基酸. OsCCR与其他植物中同类酶在氨基酸水平上有70%的相似性和30%的相同性, 含有保守的辅酶Ⅱ(NADP)结合位点及可能为该酶催化位点的特征序列. Northern杂交证实, 该基因产物广泛存在于水稻根、茎和叶等各组织中, 在茎中表达量较高. 组织原位杂交结果表明, OsCCR 基因在维管束及新生侧根中有强烈的表达信号, 与该基因编码的酶的木质素合成特性相吻合. OsCCR 基因的克隆、组织定位及生物化学方面的研究将有助于深入了解木质素形成的分子机理, 并为通过遗传工程的手段改善植物的机械性能以获得低木质素纸浆原料打下基础.