赛葵黄脉病毒: 一种含有卫星DNA的双生病毒新种

从云南红河地区表现黄脉症状的杂草——赛葵上分离到病毒分离物Y47. 对Y47进行DNA-A的全序列测定, 结果表明, Y47 DNA-A全长2731个核苷酸, 基因组具有典型的双生病毒科病毒特征, 即编码6个ORFs, 其中病毒链编码AV1(CP)和AV2共2个ORFs, 互补链编码AC1~4共4个ORFs. 对基因组进一步比较发现, Y47 DNA-A与秋葵黄脉花叶病毒分离物201(GenBank登录号: AJ002451)的同源性最高, 达77%, 而与其他双生病毒的同源性均在76%以下, 表明Y47是双生病毒的一个新种, 命名为赛葵黄脉病毒(MYVV). 利用DNAβ的特异性引物beta01和beta02, 从Y47中扩增到卫星DNA分子(Y47β). 序列分析表明, Y47β全长1348个核苷酸, 至少在其互补链上编码一个有功能的ORF(C1). Y47β的全序列与Multan棉花曲叶病毒和Rajasthan棉花曲叶病毒的DNAβ的核苷酸同源性最高, 为62%~67%, 而与其他已报道的DNAβ的同源性均低于46%. 系统关系树分析表明, 卫星DNAβ分子与其辅助病毒是共同进化的.     

与烟草曲叶病毒伴随的新型DNA分子鉴定

根据已报道的两种粉虱传双生病毒DNAβ分子的保守序列设计引物，利用PCR技术从烟草曲叶病毒Y5和Y8分离物扩增到一类环状DNAβ分子，其全长分别为1333和1338nt，序列分析表明，Y5DNAβ可能编码8个可读框（ORFs），病毒链和互补链各含有4个ORFs；Y8DNAβ可编码7个ORFs，病毒链含有4个ORFs，互补链含有3个ORFs，除茎环结构TAATATTAC外，DNAβ与烟草曲叶病毒Y5和Y8基因组DNA－A序列几乎无同源性，Y5和Y8的DNAβ全长核苷酸序列同源性较高，为85％，而与已报道的胜红蓟黄脉病毒（AYVV）DNAβ及棉花曲叶病毒（CLCuV）的两个DNAβ的同源性为51％－65％，免疫捕获PCR及粉虱传毒实验表明，DNAβ分子包裹在双生病毒粒子中，并伴随病毒由烟粉虱传播。     

从烟草上分离的中国番茄黄化曲叶病毒及其卫星DNA的全基因组结构特征

从我国云南省红河地区表现曲叶症状的烟草上分离到病毒分离物Y8, Y36和Y38. 用14种针对双生病毒粒子的单克隆抗体进行三抗体夹心ELISA测定, 结果表明, 病毒分离物Y8, Y36和Y38的抗原表位型与中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)相似. 对Y8, Y36和Y38基因组DNA-A全序列进行了分析, 其全长分别为2727, 2730和2730个核苷酸, 均编码6个ORFs, 其中病毒链编码AV₁(CP)和AV₂两个ORFs, 互补链编码AC₁~AC₄四个ORFs. DNA-A全序列、基因间隔区核苷酸序列及各ORF编码的氨基酸序列比较分析表明, Y8, Y36和Y38均属于TYLCCNV. 从病株Y8, Y36和Y38中还分离到一类卫星DNA分子(DNAb), 全长分别为1338, 1339和1338个核苷酸. 3个DNAb分子的核苷酸全序列的同源性为98%~99%, 且互补链上均含有编码126个氨基酸的C1 ORF.     

烟草曲叶双生病毒分子进化的初步研究

烟草曲叶病是烟草的主要病害之一,流行于热带和亚热带地区,其病原是烟草曲叶双生病毒(Tobacco leaf curl virus,TbLCV).TbLCV由烟粉虱(Bemisia tabaci)传播,能侵染属于茄科(Solanaceae)和番木瓜科(Caricaceae)的许多植物.在我国蔡健和等曾报道TbLCV的寄主范围、传毒媒介和与非洲木薯花叶双生病毒的血清学关系.本文首次报道TbLCV外壳蛋白基因的核苷酸序列,在外壳蛋白氨基酸水平上比较与其它双生病毒的分子进化关系,为进一步研究其分子生物学特性奠定了基础.     

Allexivirus属的一个新成员——大蒜病毒E的基因组全序列测定和系统树分析

测定了一个从浙江余杭大蒜中分离到的Allexivirus属成员的基因组全序列，单链正性病毒基因组含8451个核苷酸，6个ORF，与其他Allexivirus属成员的基因组全序列的核苷酸同源性仅为62.8%～64.8%；ORF1～ORF6编码蛋白的氨基酸同源性分别为67.6%～78.5%，55.4～66.2%，56.7%～66.4%，40.3%～55.6%，66.3%～79.9%和52.2%～68.8%，进一步分析显示，此病毒与其他病毒的差异和该属中远缘病毒间的差异相似，外壳蛋白核心区域氨基酸序列同源性仅为63.9%～79.8%，远低于该属不同病毒的国际分类标准，应归类为Allexivirus属的新成员，命名为大蒜病毒E，病毒不同编码蛋白序列的进化树分析也进一步证明了该病毒与其他病毒的亲缘关系。     

导致田间烟草曲叶病的又一病毒(非中国烟草曲叶病毒)

对病毒分离物ＤＮＡ序列分析的结构表明，除曾报道的中国烟草曲叶病毒，还存在另一种能引起我国广西地区烟草曲叶病的双生病毒。该病毒ＤＮＡ－Ａ由２７３４个核苷酸组成，与ＴｂＬＣＶ－ＣＨＩ的已知的部分序列不同。其大基因间隔区（ＬＩＲ）长２６９ｎｔ，病毒链有两个ＯＲＦ：ＡＶ１（１１５ａａ）和ＡＶ２（外壳蛋白基因，２５６ａａ）；病毒互补链有４个ＯＲＦ：ＡＣ１（复制酶基因，３６１ａａ）、ＡＣ２（反式激活蛋白，１３     

中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ A-Rich区的功能鉴定

DNAβ是近年来在一些单组分双生病毒中发现的一类新型卫星DNA分子, DNAβ对于这些病毒诱导典型的病害症状是必需的. DNAβ上含有3个相对保守的区域: 共同区、βC1基因和A-Rich区(A含量 > 60%). 在对中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(TYLCCNV-Y10)DNAβ βC1基因的功能突变研究的基础上, 对TYLCCNV-Y10 DNAβ上的A-Rich区进行了功能鉴定. 对TYLCCNV-Y10 DNAβ A-Rich区进行缺失突变后发现, A-Rich缺失突变体依然能够在植物中稳定复制和系统移动, 因此A-Rich区对于DNAβ的复制并不是必需的. 免疫捕获PCR检测发现, A-Rich缺失突变体能够包裹在TYLCCNV-Y10 DNA-A编码的外壳蛋白之中, 表明它并不能决定DNAβ的包裹, 但是A-Rich区的缺失使病毒症状减弱.     

水稻条纹叶枯病毒基因组含vRNA_2 ORF片段的克隆、序列分析及其在原核中的表达

水稻条纹叶枯病毒(rice stripe virus,RSV)是柔丝病毒组的典型代表,其基因组由4种ss-RNA及相应低含量的4种dsRNA组成,其中,RNA1为负链性质,编码RNA多聚酶;RNA2～4均为双义编码性质(ambisense-coding strategy)。为研究该病毒RNA非编码区等调控元件在病毒基因组双义表达过程中的功能,采用反转录-聚合酶链式反应方法(RT-PCR),扩增出覆盖RSV RNA2 5′末端非编码区、vRNA2OrFT区、基因间非编码区及vcRNA2 ORF部分区域的REPI片段(1 159bp)。将此扩增产物克隆于载体pGEM-7Zf( )的Sma Ⅰ位点上并进行了核苷酸序列测定。结果表明,中国分离物与日本分离物的REPI片段具极高的序列同源性。将REPI片段克隆到原核高效表达载体pJW2的P_RP_L启动子下游,经温度诱导,获得了高效     

鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的基因组特点

在完成鸡减蛋综合征病毒中国株ＡＡ２全基因组核苷酸序列测定的基础上,对其基因组的结构特点进行了分析,结果表明：ＡＡ２株基因组具有腺病毒科成员的某些结构特点,尽管核苷酸及氨基酸序列的同源性较低但是位于Ｅ２区中编码与病毒繁殖和基因具有复制相关的一些酶类或调节蛋白,以及组装病毒颗粒所需的结构蛋白等与其他腺病毒相似。     

鸡传染性支气管炎冠状病毒北京分离株全基因组序列的测定及其特征分析

鸟类传染性支气管炎病毒(AIBV)属于冠病毒科, 冠状病毒属, 是单股线状、正链RNA病毒, 基因组全长近28 kb, 具有3′多聚A尾和5′帽子结构的特征. 采用PCR产物克隆测序和引物步移(primer walking)直接测序结合的方法, 完成了IBV北京分离株的全基因组序列的测定. 该毒株基因组序列全长为27733 bp, 生物信息学分析表明, 它具有10个明显的可读框(ORF); 通过基因定位后其基因排序为: 5′-orf1a-orf1ab-s-3a-3b-e-m-6a-6b-n-3′. 对IBV北京分离株的全基因组序列, 与报道的IBV及造成人类严重急性呼吸综合征(SARS)的病毒(SARS-CoV)进行了比较分析. 结果表明, AIBV是一种变异较大的病毒, 其全基因组序列与国外公布的AIBV全基因组序列相似性仅有85.2%, 与国内报道的不完整AIBV序列比较, 相似性也只有91.2%; 而与SARS病毒基因组全序列比较, 相似性仅为50.8%, 说明它与SARS-CoV关系不大. 同时, 还使用clustalw 1.81 和 Treeview软件构建了冠状病毒的全序列、S蛋白、M蛋白和N蛋白的系统发生树, 结果表明, 鸡IBV北京分离株是第3组病毒的惟一成员, 它与SARS-CoV存在很大的遗传距离. 这项研究将对我国鸡传染性支气管炎病原的鉴定和疾病的控制起到重要的作用.     

棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆

采用功能筛选策略从以PVX病毒载体建立的棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae) cDNA文库中克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段). 以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA文库, 采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana), 从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆. 对上述阳性克隆进行序列测定和分析, 结果显示, 其中7个与已知的基因具有较高的同源性, 其中PBC43编码一个特异的elicitin蛋白; PBC163编码一个Rab蛋白, 与大豆疫霉的RAB同源性较高; PBC241编码抗增殖蛋白(prohibitin); PBN62编码一个热激蛋白60 (HSP60). 还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因, 提示可能是该病原菌特异的激发子基因. 上述结果表明, 利用病毒表达载体构建cDNA文库, 用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生过敏反应的激发子基因, 该方法可望为其他植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台.     

片段的序列测定与分析

对经亚克隆后的鸡痘病毒 (fowlpoxvirus,FPV) 2 82E4株 7.3kbBamHⅠ片段 ,用ABI377DNA测序仪荧光标记法进行了序列测定 ,并应用DNAsis软件同GenBank中已知的FPV序列和痘苗病毒 (vacciniavirus,VV)Copenhagen株的全序列进行了同源性比较 ,发现与鸡痘病毒MunichHP 438株 1 1 .2kbBamHⅠ片段的序列同源 .此外 ,对所测序列的开放读码框架 (openreadingframes,ORFs)所编码的氨基酸序列同上述VV株中所有ORF的氨基酸序列进行了同源性比较 ,并对各ORF编码蛋白的信号肽、跨膜区的存在与否进行了分析     

中国番茄黄化曲叶病毒和烟草曲茎病毒AC2和AC4蛋白为RNA沉默的抑制子

中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物（TYLCCNV-Y10）能系统侵染本氏烟（Nicotiana benthamiana）等寄主植物但不诱导明显的症状，而烟草曲茎病毒Y35分离物（TbCSV-Y35）单独侵染则诱导曲叶等症状。对表达GFP基因的转基因本氏烟的接种试验表明，TYLCCNV-Y10不回复已建立的GFP沉默也不抑制GFP沉默的建立，而TbCSV-Y35能部分回复已建立的沉默且能在新叶抑制沉默的建立。农杆菌共浸润试验发现，TYLCCNV-Y10和TbCSV-Y35的AC2和AC4蛋白都能抑制GFP的局部沉默并延迟GFP的系统沉默，为RNA沉默的抑制子。比较共浸润区GFP mRNA的积累表明，Y10 AC2与Y 35AC2蛋白具有相近的RNA沉默抑制能力，而Y35 AC4蛋白是一个比Y10 AC4蛋白更强的抑制子。因而，TbCSV-Y35和TYLCCNV-Y10致病性差异的原因可能与二者AC4蛋白的功能差异有关。     

鸡痘病毒282 E4株基因组7.3kb Bam HⅠ片段的序列测定与分析

对经亚克隆后的鸡痘病毒(fowlpoxvirus,FPV)282E4株7.3kb BamHⅠ片段 ,用ABI377DNA测序仪荧光标记法进行了序列测定 ,并应用DNAsis软件同GenBank中已知的FPV序列和痘苗病毒 (vacciniavirus,VV)Copenhagen株的全序列进行了同源性比较 ,发现与鸡痘病毒MunichHP 438株11.2kbBamHⅠ片段的序列同源 .此外 ,对所测序列的开放读码框架 (openreadingframes,ORFs)所编码的氨基酸序列同上述VV株中所有ORF的氨基酸序列进行了同源性比较 ,并对各ORF编码蛋白的信号肽、跨膜区的存在与否进行了分析.     

TNV-A~C亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate,TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录.在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明,TNV-AC亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G2184,亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G2460.进一步分析表明,亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失,但不影响病毒在烟草原生质体中的复制,说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动,是病毒造成枯斑所必需的基因.通过原核表达产物分析,证明了亚基因组RNA2中外壳蛋白(coat protein,CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG.CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明,完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的,但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响.综合以上结果,对TNV-AC的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

烟草两组分信号系统基因NTHK2

两组分信号传递系统对于生物体的生长发育及适应性反应起着非常重要的作用．以本室克隆的两组分信号系统基因ＮＴＨＫ１为探针，筛选烟草ｃＤＮＡ文库，获得了一个同源基因ＮＴＨＫ２．序列同源性分析表明ＮＴＨＫ２可能编码乙烯受体类似物，具有组氨酸激酶结构域和磷酸化受体结构域．但组氨酸激酶结构中的特定磷酸化位点组氨酸发生了变化，被天冬酰胺取化．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析表明烟草基因组中含有较低拷贝数的ＮＴＨＫ２基因．应     

TNV-AC亚基因组表达及基因编码产物对局部枯斑症状的影响

利用烟草坏死病毒A中国大豆分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate, TNV-AC)的全长侵染性cDNA克隆构建系列突变体进行体外转录. 在枯斑寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)上的侵染性检测结果表明, TNV-A^C亚基因组RNA1的转录起始位点位于基因组RNA的G²¹⁸⁴, 亚基因组RNA2的转录起始位点位于基因组RNA的G²⁴⁶⁰. 进一步分析表明, 亚基因组RNA1中p8和p6基因的翻译灭活突变可导致病毒在苋色藜上的侵染症状消失, 但不影响病毒在烟草原生质体中的复制, 说明p8和p6基因产物可能影响病毒在细胞之间的移动, 是病毒造成枯斑所必需的基因. 通过原核表达产物分析, 证明了亚基因组RNA2 中外壳蛋白(coat protein, CP)基因的可读框起始于基因组RNA的2612~2614位AUG. CP可读框核苷酸替换或缺失突变分析表明, 完整的CP蛋白虽不是病毒建立侵染所必需的, 但其翻译起始密码子区域的核苷酸序列保守性及可读框核酸序列的完整性对病毒侵染苋色藜后产生枯斑的数量、显症时间和病毒RNA的积累量具有明显影响. 综合以上结果, 对 TNV-A^C的cp基因在侵染枯斑寄主苋色藜过程中的其他功能进行了讨论.     

棉花曲叶病毒外壳蛋白基因启动子不是组织特异表达的启动子

双生病毒是一种单链ＤＮＡ病毒，来自番茄金色花叶病毒（ＴＧＭＶ）的资料表明，其外壳蛋白基因（ｃｐ）启动子在韧皮部特异表达，对新近发现并鉴定的棉花曲叶病毒（ＣＬＣｕＶ）ｃｐ启动子的研究表明，它不是韧皮部特异表达的启动子，该启动子驱动的ｇｕｓ基因表达活笥不仅存在于韧皮部，而且出现在叶肉组织和根尖分生组织中，瞬时表达研究表明，ＡＣ２激活后的ｃｐ启动子在叶肉及叶脉组织均有表达活性。     

水稻条纹叶枯病毒基因组含vRNA2 ORF片段的克隆、序列分析及其在原核中的表达

<正>水稻条纹叶枯病毒(rice stripe virus,RSV)是柔丝病毒组的典型代表,其基因组由4种ss-RNA及相应低含量的4种dsRNA组成,其中,RNA1为负链性质,编码RNA多聚酶;RNA2～4均为双义编码性质(ambisense-coding strategy)。为研究该病毒RNA非编码区等调控元件在病毒基因组双义表达过程中的功能,采用反转录-聚合酶链式反应方法(RT-PCR),扩增出覆盖RSV RNA2 5′末端非编码区、vRNA2OrFT区、基因间非编码区及vcRNA2 ORF部分区域的REPI片段(1 159bp)。将此扩增产物克隆于载体pGEM-7Zf(+)的Sma Ⅰ位点上并进行了核苷酸序列测定。     

猪瘟病毒石门株全基因组cDNA文库构建、序列测定及分析

根据已发表的猪瘟病毒序列 ,设计并合成了 1 8对覆盖全长基因组的引物 .应用RT PCR技术从猪瘟病毒石门株感染的猪血中扩增出各相应的cDNA片段 ,分别克隆 ,构建了石门株全基因组的cDNA文库并完成了序列测定 .石门株基因组全长 1 2 2 98nt,其中 5′端和 3′端非编码区长度分别为 373和 2 31nt,中间一个大的开放阅读框长 1 1 6 97nt,翻译成一个包含3898个氨基酸残基的多聚蛋白 .还对石门株序列与其他猪瘟病毒序列进行了分析比较