血小板生成素在毕赤酵母中的表达

以人胎肝cDNA文库为模板,用PCR和DNA重组技术,将TPOcDNA克隆到pGEM     

毕赤酵母表达猪胃蛋白酶的研究

利用已有的猪胃蛋白酶原A cDNA,构建毕赤酵母pPIC3．5K—pA胞内表达载体．经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得2株高表达的重组子,并研究了在不同pH、不同诱导时间、不同起始浓度和甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低．结果表明：在pH7、诱导72h、起始诱导浓度为OD600为2、甲醇诱导浓度为1％时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6．46U／mL．     

人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达

人胰激肽原酶(hPK)编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His^-Mut⁺) ,筛选His⁺Mut^s 型高拷贝菌株,摇瓶诱导表达重组hPK。经SDS-PAGE凝胶电泳分析确定表达重组蛋白相对分子质量为37500,产量达40mg/L,质量分数占总蛋白的30%以上。初步浓缩的重组hPK经测定具有酶活性,表明其在毕赤酵母中得到了正确的表达,每mL酶活达0.717nmol/s。     

巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris,P .pastoris)是一种广泛使用的外源基因表达系统 ,该系统不仅具有高效表达、高稳定、高分泌、高密度生长等特点 ,而且可以对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工等显著优点。该研究对巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作了简要的综述     

人甲状旁腺素在甲醇毕赤酵母中的分泌表达

选用酵母偏爱的密码子,人工合成长度为282bp的人甲状旁腺素(hFTH)基因,将其克隆于M13载体中,DNA测序验证正确。通过PCR从含有hFTH基因的M13载体获得了该基因,将其插入到含有AOX1启动子和α因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中,构建了重组质粒pPIC9K-hFTH,电击法转化甲醇毕赤酵母(Picha pastoris)GS115菌株,经G418筛选得到高拷贝转化子,甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明在9．3kDa处有明显的诱导蛋白带,与报道的hFTH的相对分子质量相近;酶联免疫沉淀法(ELISA)检测证明表达的蛋白具有hFTH免疫活性为132ng／L。     

葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高效分泌表达

为了获得高效分泌表达葡萄糖氧化酶(GOD)的毕赤酵母,采用黑曲霉来源的GOD基因序列,按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,构建AOX1启动子诱导的分泌表达载体pPIC9K-GOD和重组菌G/GOD,通过提高遗传霉素G418浓度筛选到第1代高拷贝高产量重组菌G/GODM,单位细胞干重胞外产酶水平可达5843.2 U/g,...     

鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2(ChIL-2)基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K 构建重组表达载体pPIC9K/ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母(Pichia methanolica)GS115 甲醇利用型重组表达菌株.经SDS-PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16 ku与14 ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质.     

毕赤酵母表达系统的实际应用研究

在DNA体外重组和异源表达技术中,酵母表达系统是重要的一个组成部分。对于它的优势,大量中外文献用实例证明,用综述总结。酵母菌是最简单的真核模式生物,兼有原核、真核两种表达系     

肿瘤抑制因子p53蛋白在毕赤酵母中的克隆表达

TP53基因在调控细胞信号通路和抑制肿瘤细胞中发挥着重要作用.本研究利用毕赤酵母表达系统以获得大量重组p53蛋白,为此,本文将人TP53基因克隆至表达载体p PIC3.5K,电转化进入毕赤酵母GS115,通过组氨酸筛选和G418筛选,获得高拷贝稳定转化子.SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明p53蛋白可以在毕赤酵母中表达.本研究所获酵母菌株为今后大规模生产重组p53蛋白奠定了基础.     

抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达

采用PCR技术改造抗菌肽AD基因,将其C末端改造为Asn编码,改造后的抗菌肽Cecropin AD基因克隆到pPICZα－A载体上,构建成酵母重组分泌型表达载体,转化毕赤酵母（Pichia pastoris)受体菌GS115中,采用zerocin抗性标记筛选重组转化子,经摇瓶发酵,浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测。结果表明,改造后的Cecropin AD基因在毕赤酵母中获得了表达,表达产物经α－Factor信号肽引导分泌到胞外,具有较强的杀菌活性。     

重组肠激酶在甲醇酵母中高效表达的培养条件研究

对重组肠激酶在甲醇酵母中高效表达的发酵条件进行了优化,并在BiofloⅢ发酵罐中实现了高密度培养和高效表达。结果表明;温度30C,培养基pH6．0,当酵母密度达到200A600mm以上时,加入无水甲醇,控制甲醇的流加体积,使其终体积分数为1．0％～3．O％,继续诱导培养72h左右,酵母菌密度可达到150g／L,重组肠激酶总活性可达58kIU／L发酵液。     

Cloning and Expression of Recombinant Human Thymosin in Yeast Pichia pastoris

The gene of human thyrnosin alpha 1 (hT(1)was synthesised according to favorite eodons of Pichia pastoris by PCR. N-terminal 28 amino acid residues of 40S ribosomal protein (RP), S24Ethat is N-aeetylserine were replaced by hT( 1 for the constitution of hT(1-RP fusion gene in order to express acetyllated thyrnosin α1. And also, the Asn-Gly bond was designed to faeiliate isolation of the target protein. The fusion gene was cloned into the expression vector, pPIC/gK. The constructs were transformed into HIS4 mutant strain GS115 by eleetroporation. Both SDS-PAGE analysis and Western blot analysis indicated that the fusion protein was expressed successfully.     

重组毕赤酵母体系生成PlUGT1蛋白适宜条件研究

通过单因素试验分别研究pH值和温度对重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1生长以及甲醇浓度、pH值和温度对诱导表达PlUGT1蛋白的影响.结果表明,pH6.5和30 ℃是培养重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1最佳的生长条件,重组毕赤酵母GS115/pPIZA-PlUGT1诱导表达蛋白的适宜条件为甲醇体积分数0.5%、30 ℃和pH5.0,该条件下培养72 h,培养液中的蛋白质量浓度为0.721mg/mL.     

烟曲霉脂肪酶B在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

从烟曲霉Aspergillus fumigatus GIM3.20中克隆获得了一种脂肪酶B基因(AFLB)。通过序列比对,发现AFLB与南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的氨基酸序列有31%的一致性,两者同属CALB家族脂肪酶;AFLB 含有与家族其他成员类似的保守五肽序列(SWSQG),预测AFLB的催化三联体分别为S233、D318和H361,其中Ser233位于保守五肽序列中;此外AFLB含有一段N-端延长序列(由第1~128位氨基酸组成),是曲霉属脂肪B的特有序列。在毕赤酵母中成功地异源表达了脂肪酶AFLB,并通过亲和层析进行了纯化。SDS电泳结果显示,该酶存在部分高度N-糖基化和部分无糖基化的两种形态,对应分子量分别为45~66kDa和42kDa。酶学性质表征结果显示,重组脂肪酶AFLB最适反应pH 值为7.0,最适反应温度为40℃,并在50℃以下具有较好稳定性,其最适底物为肉豆蔻酸对硝基苯酯。脂肪酶AFLB与CALB有高度亲缘性,具有潜在的工业应用前景。     

重组人骨形态发生蛋白4在毕赤酵母中的表达研究

试图建立人骨形态发生蛋白-4在毕赤酵母(Pichia pastoris) 中的表达技术.包括:将hBMP4成熟片段从全长cDNA亚克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上,构建能表达rhBMP4的载体质粒pPIC9K-hBmp4.经转化Pichia pastoris宿主菌株GS115,PCR鉴定基因整合后,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达上清液经SDS-PAGE和Western-blot 分析,结果表明rhBMP4以单体形式分泌到发酵上清液中,单体分子质量大小约为26 ku,摇瓶表达量达到20.13 μg/mL.     

屋尘螨过敏原Der p 1在毕赤酵母中的重组表达与纯化

基于巴斯德毕赤酵母表达系统探讨了屋尘螨过敏原Der p 1的重组表达与纯化。首先,采用毕赤酵母GS115表达密码子优化的全长编码基因PreProDer p 1,其产量可达100 mg/L,进一步共表达分子伴侣实现产量提高到140 mg/L,并实现3 L反应器发酵产量提高到1 g/L。其次,对上述重组蛋白发酵液分别使用阳离子交换层析及亲和层析进行了纯化工艺优化,目的蛋白得率达到60.7%。本研究为后续PreProDre p 1诊断试剂盆的开发提供了参考。     

猪胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的表达

利用已有的猪胃蛋白酶原AcDNA,构建毕赤酵母pPIC3.5K-pA胞内表达载体.经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得两株高表达的重组子,研究它们在不同pH值、不同诱导时间、不同起始浓度和不同甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低.结果表明:在pH值为7、诱导72h、起始诱导浓度的OD600为2、甲醇诱导浓度为1%时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6.46U/mL.     

甜蛋白Monellin在巴斯德毕赤氏酵母中的胞内表达

将PCR扩增得到的Monellin基因片段插入Pichia pastoris胞内表达质粒Ppic3.5k‘,然后转入Pichia pastoris SMD 1168受体菌中,用G418筛选高拷贝菌株,并进一步对其进行PCR鉴定,获得的阳性克隆菌株经甲醇诱导60h,SDS-PAGE结果显示菌株破壁液中含有表达的Monellin,其大小约为11ku,并具有甜度。