转基因肝星状细胞定向诱导骨髓Thy-1+β2M-细胞向肝细胞分化

体内移植研究表明, 骨髓来源的干细胞具有向成熟的肝细胞分化的能力. 然而, 成体干细胞向肝细胞诱导分化的效率、分化细胞的功能状态、微环境对细胞分化的影响等均存在许多疑问. 以高效、稳定表达肝细胞生长因子的肝星状细胞株CFSC/HGF作为饲养细胞, 成功地将大鼠骨髓来源的Thy-1⁺β₂M^-细胞(bone marrow derived Thy-1⁺β₂M^-cells, BDTCs)诱导为肝细胞, 经RT-PCR和免疫荧光化学检测证实, 该条件下诱导后的BDTCs表达幼稚或成熟肝细胞特异性的基因, 分化细胞具有成熟肝细胞特有的靛青绿摄取排泌、氨基代谢和白蛋白分泌的功能, 提示肝细胞生长因子、肝脏非实质细胞及其产生的细胞外基质为骨髓干细胞向肝细胞分化提供了适宜的微环境. 这为以骨髓干细胞为基础的再生医学在终末期肝病治疗中的应用提供了理论和技术上的支持.     

人胚胎干细胞体外诱导分化为肝脏细胞

建立诱导人胚胎干细胞分化为肝细胞的方法, 为细胞移植与生物人工肝等肝病替代治疗提供新的种子细胞来源. 将人胚胎干细胞在细菌培养皿中悬浮培养7 d, 形成囊性拟胚体, 接种至包被有Ⅰ型胶原的组织培养皿, 以含有地塞米松、胰岛素的条件培养液进行诱导, 通过光学显微镜和电子显微镜观察细胞的形态变化; 免疫细胞化学和RT­PCR检测细胞诱导前后肝细胞特异性基因的表达; 用靛青绿摄取、排泌实验、糖原染色实验及白蛋白、尿素分泌检测肝细胞的相关功能. 条件诱导液培养14 d, 细胞形态由圆形变为多角形和长梭形, 出现双核或多核, 表面有微绒毛, 胞浆内含丰富的线粒体、内质网、溶酶体及糖原颗粒等; 这些细胞表达幼稚或成熟肝细胞特异性的AFP, ALB, CK18, CK19和CYP1B1等基因, 并具有靛青绿摄取、排泌、贮存糖原和分泌白蛋白、氨基代谢生成尿素等功能. 形态、表型及功能的实验结果均证实人胚胎干细胞经上述方法培养可以向肝细胞分化.     

人骨髓来源的间充质干细胞在聚乳酸羟基乙酸材料上增殖及向内皮细胞分化的研究

功能的实现一直是血管组织工程中最关键的问题. 目前临床上小口径血管替代物的致命弱点就是血栓形成及其所导致的血管功能丧失, 而这其中重要的原因就是血管替代物内皮功能的不健全. 本研究以人骨髓来源的间充质干细胞为种子细胞, 以NaCl颗粒制孔/浸出法制备的聚乳酸羟基乙酸多孔薄膜为支架材料, 通过细胞增殖实验确定NaCl含量为75%, 粒径大小为30~50 μm的聚乳酸羟基乙酸多孔材料最适合间充质干细胞黏附生长. 诱导分化后的细胞表达Flk-1, Ⅷ因子和CD34内皮细胞特有的标志, 具有内皮细胞特有的Weible-palade (W-P)小体, 摄取低密度脂蛋白, 并且分泌前列腺素, 说明人骨髓来源的间充质干细胞不仅与聚乳酸羟基乙酸多孔薄膜材料具有理想的生物相容性, 并不失其向有功能的内皮细胞分化的潜能, 这为血管组织工程解决内皮化问题提供了实验基础.     

胚胎干细胞向肝系细胞定向分化及其在肝再生中的应用

细胞移植和生物人工肝(bioartificial liver, BAL)作为终末期肝病的辅助治疗方法, 在越来越受到广泛关注的同时, 也面临着细胞来源、数量限制、存活期短、功能迅速降低等问题, 因此迫切需要寻找新的、合适的细胞来源. 胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)是从囊胚内细胞团(inner cell mass, ICM)中分离获得的、具有无限增殖能力和分化全能性的原始细胞, 能在特定的诱导条件下分化成各种组织 特异性细胞, 在临床上具有极其广阔的应用前景, 其向肝系细胞的定向分化使其可能成为肝脏细胞移植和BAL的一个重要细胞来源. 目前, 研究重点在于控制分化过程以获得足够数量的所需类型细胞. 本文概括了肝脏的发育与分化, 综述了ESC向肝系细胞定向诱导分化的最新研究进展, 并对其在肝再生中的应用和存在问题也进行了探讨, 希冀对该领域的研究提供一些新的思路.     

可溶性Jagged 1/Fc嵌合蛋白诱导髓系树突状细胞的分化和成熟

直接用可溶性Jagged 1/Fc嵌合蛋白体外诱导小鼠髓系树突状细胞(dendritic cells, DC)的分化和成熟. 建立体外诱导和扩增小鼠骨髓DC的模型, 在共聚焦显微镜下观察Jagged 1/Fc对重组粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(rmGM-CSF)和白细胞介素-4 (rmIL-4)诱导小鼠骨髓源性DC的形态学的影响. 用荧光标记单克隆抗体染色结合流式细胞术检测Jagged 1/Fc对DC分化标记CD11c和成熟标记MHC-Ⅱ, CD86, CD80和CD40表达的影响. 结果显示, Jagged 1/Fc不影响rmGM-CSF和rmIL-4诱导DC分化的形态特征, 能促进其诱导DC分化和成熟; 在DC形态特征和共刺激分子的表达谱上与细菌脂多糖(LPS)明显不同, Jagged 1/Fc刺激MHC-Ⅱ和CD40表达的作用显著弱于LPS, 刺激CD80的表达接近LPS, 不影响CD86的表达; 单独Jagged 1/Fc不能维持DC的生长、分化和成熟. 这些说明可溶性Jagged 1/Fc嵌合蛋白能影响髓系DC的分化和成熟, 但与LPS的作用不同, 可作为新的免疫调节剂用于研究与开发.     

胎儿骨髓间充质干细胞中SSEA-4阳性表达细胞的分离和检测

为了验证成体干细胞中全能性干细胞存在的可能性, 以SSEA-4抗原为筛选标志, 利用免疫磁珠筛选技术从胎儿来源的骨髓间充质干细胞(fetal mesenchymal stem cells, fMSCs)中筛选并培养得到SSEA-4表达阳性的fMSC-SSEA-4细胞, 从形态学、生长曲线、表面标志及细胞周期、核型分析等方面检测其生物学性状, 并通过Oct-4及SSEA-4抗体的表达及致瘤性等方面分析其全能性状. 同时观察了fMSC-SSEA-4细胞的诱导分化能力. 结果发现, fMSC-SSEA-4细胞的形态学表现、细胞周期和生长曲线检测与fMSCs无明显差异; fMSC-SSEA-4细胞Oct-4和SSEA-4抗体表达阳性, 并且表现为正常的二倍体核型, 无明显的致瘤性状. 在不同的诱导条件下, fMSC-SSEA-4细胞可向成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞分化. 实验结果提示, fMSCs中存在有全能干细胞性状的一群细胞, 从而为进一步深入研究和更好地应用fMSCs提供了理论依据.     

干细胞生物学研究的现状与展望

干细胞是个体发育过程中产生的具有多向分化能力的一类细胞，可作为体外模型用于研究个体的发育机制，同时在临床相关组织缺陷性疾病的细胞替代治疗和基因治疗中有巨大的作用价值。造血干细胞的体外扩增和诱导分化技术已经比较成熟，造血干细胞移植和基因治疗已得到广泛开展，这为干细胞的研究提供了成功的范例。近来人干细     

体外诱导脑膜来源的iPS 细胞形成神经样的细胞

单层贴壁的培养方法能够在无血清的情况下将胚胎干细胞(ES 细胞)诱导分化形成神经 样的细胞. 重编程小鼠脑膜细胞产生的多能干细胞(iPS 细胞) C5, 也可以运用诱导ES 细胞神经 发生的方法来诱导神经特异性标志基因Sox1, Sox3, Pax6, Nestin 和Tuj1 的表达; 与之相反, 随 着分化的进行, ES 细胞特异性的标志基因Oct4 和Nanog 的表达量迅速降低. 通过细胞免疫荧 光技术, 可以检测到大量Pax6 和Nestin 阳性的神经前体细胞的存在, 并且随着时间的推移, 这 些前体细胞能够分化形成3 类中枢神经系统的细胞, 分别是神经元、星形胶质细胞和少突胶质 细胞. 体外诱导iPS 细胞形成的个体特异性细胞可以作为研究遗传类疾病机制的工具, 并且可 用来治疗机能紊乱和年老的神经组织. 此外, 脑膜细胞由于高表达胚性调控因子Sox2, 更容易 被逆分化形成iPS 细胞, 为此将更加胜任于临床治疗应用.     

维持Oct-4基因表达对小鼠胚胎干细胞分化的影响

通过导入外源性表达的Oct-4基因，使小鼠胚胎干细胞（ES细胞）在维甲酸诱导分化后仍继续维持Oct-4基因的表达，建立了Oct-4基因维持表达的ES－O细胞株。研究发现，在缺乏干细胞分化抑制因子LIF的情况下，Oct-4基因的维持表达本身并不能维持ES－O细胞的干细胞特性；在LIF存在时，Oct-4基因的维持表达增强了ES－O细胞维持干细胞未分化状态的能力, 而且部分抑制了维甲酸诱导的细胞分化，说明Oct-4基因与LIF协同作用才能维持ES细胞的未分化状态，在细胞分化过程中，ES－O细胞倾向于向神经细胞分化，提示Oct-4基因的维持表达可能与神经外胚层分化相关。     

激活Notch信号通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

Notch是影响细胞分化的重要信号通路之一. RT-PCR检测到人骨髓来源的间充质干细胞(MSC)表达Notch1, 其配体Jagged1及下游分子DTX1, 表明Notch信号可能调节MSC的增殖分化. Notch1胞内区(ICN)是Notch蛋白的活性形式, 通过载体介导将ICN转染细胞就可以在没有配体存在的情况下激活Notch信号. 我们克隆了ICN基因, 构建了携带ICN的逆转录病毒载体, 感染MSC后用地塞米松(DEX)诱导其向成骨细胞分化. 转染ICN激活Notch信号的MSC较对照细胞在分化过程中碱性磷酸酶活力升高, 钙的沉积增加, 表明Notch信号有促进MSC向成骨细胞分化的作用.     

恒河猴骨髓间充质干细胞在体外向角膜上皮前体细胞的诱导分化

组织工程生物角膜是角膜的理想替代物, 为严重眼表疾病的治疗带来了希望. 然而, 足量种子细胞的获得是构建生物角膜的瓶颈. 骨髓间充质干细胞(MSC)具有多向分化潜能. 为探讨MSC能否分化为角膜上皮细胞, 将分离培养的灵长类动物恒河猴P3代MSC在体外基质微环境中通过3种方案诱导, 对诱导前后的MSC用形态学观察、免疫组织化学技术和流式细胞仪检测评价其分化情况. 结果显示, Ⅲ组MSC表现出角膜上皮前体细胞的形态特征, 检测出角膜上皮前体细胞的标志, 包括integrinb1, Cx43, Pax6和P63的表达. 这说明, 在适宜条件下, MSC能够诱导分化为角膜上皮前体样细胞, 有可能作为构建生物角膜的种子细胞来源, 进行眼表修复.     

细胞生长因子

导言正常组织生长与细胞增殖、体积增大、迁移、分化和老化等及各个过程间复杂的相互作用有关,同时受时间和解剖的严密制约。虽然诸如生长激素和甲状腺素等典型内分泌类激素,能影响组织总的生长和速率,但它们并非是组织生长时细胞间的基本信号。当胚胎或胎儿迅速发育时,肽生长因子与组织诱导、干细胞克隆生长、器官发生相关联。并且是卵巢周期、睾丸功能、长骨生长、创伤愈合、人类生殖等重要因素。理化特性和解剖定位肽生长因子主要特征如表所述。它是分子量小于30000的典型蛋白质。如同经典的内分泌激素,肽生长因子以近程分泌和自身分泌激素形式,在组织周围合     

胚胎干细胞及其在神经系统疾病中的应用

胚胎干细胞是由桑椹胚、内细胞团或原始生殖细胞经体外抑制分化培养后分离筛选出的具有发育全能（或多能）性的细胞。它可在体外无限增殖，并且经诱导后可定向分化为多种细胞类型。因此它可作为细胞替代疗法中的种子细胞来源，为许多疑难疾患的治疗提供崭新的思路和良好的前景。近年来，随着社会的老龄化，神经系统退化性疾病在人类疾病谱中占越来重要的地位，将胚胎干细胞用于此类疾病的治疗，在动物实验中已取得初步成效。此外，胚胎干细胞变可用于治疗脊髓损伤等。本文将就近年来有关胚胎干细胞的分离及鉴定、胚胎干细胞的自我更新、定向分化及其在神经系统疾病中的应用等方面的研究进展作一综述。     

JWA参与调控细胞分化的结构和功能

为阐明新基因JWA的结构特征、表达调节规律和生物学功能，通过基因重组和测序，确定了大鼠JWA同源基因和人JWA基因621bp的启动子序列；用RT－PCR法，分析了培养细胞株和原代白血病细胞经药物处理后JWA mRNA的表达情况，发现TPA处理后JWAmRNA水平在肿瘤细胞株与非肿瘤细胞株中呈反向变化：用维甲酸治疗前的M3型白血病人骨髓白细胞，其JWA基因对多种诱导分化剂处理不敏感；而用维甲酸治疗10d后再用诱导分化剂处理，则JWA基因的转录水平均被下调，提示M3型白血病细胞在ATRA作用下的分化可能是启动JWA信号转导通路的前提。而JWA基因的表达下调是否为白血病细胞进一步分化及4HPR，As2O3和TPA等诱导细胞凋亡所必需，值得进一步探讨。JWA基因在不同种属中保持较为稳定的序列特征，说明该基因在生物进化中可能较保守并可能具有相近的生物学功能。     

信号转导与细胞癌变

细胞内存在两类调节细胞生长的基因-生长促进基因（即原癌基因或细胞癌基因）和生长抑制基因（抗癌基因和诱导终端分化基因），这些基因编码生长因子（或其受体）、蛋白激酶、某些酶类、鸟苷酸结合蛋白（G蛋白）、转录调节因子以及其他在信号转导中起重要作用的蛋白组分，这些基因的突变或表达异常导致其编码蛋白（癌蛋白、抗癌蛋白）数量或功能异常，引起细胞生长调控紊乱，无限生长、增殖，最终导致细胞癌变，因此，研究认号转导机制对于阐明细胞癌变的化学本质具有重要意义。     

小鼠骨髓基质细胞系BMSC1的建立及鉴定

对T细胞发育的研究表明:胸腺是T细胞发育的主要场所,来源于骨髓的pro-T细胞进入胸腺,在胸腺微环境的作用下,经阳性和阴性选择逐渐发育为成熟的T细胞输出胸腺。但目前对T细胞在骨髓内是如何由造血干细胞分化成pro-T细胞的发育过程还不太清楚,骨髓微环境与此过程密切相关。现在的研究表明骨髓造血微环境主要是由骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cell,BMSC)及其分泌的细胞外基质、细胞因子三者共同组成,影响着造血细胞的粘附、增殖和分化。其中骨髓基质细胞是关键成分,主要包括成纤维细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞等。各种基质细胞网状分隔构成微环境支架,造血细胞在此微环境支架中与基质细胞相互作用并接受基质细胞分泌的造血因子的刺激而增殖分化。研究T细胞在骨髓内发育途径及分化机理,须分析BMSC类型、功能及其与发育中的T细胞的相互作用效应,其体外培养可以仔细分析骨髓微环境的作用。为此,我们继建成了小鼠胸腺基质细胞系以后,开始建立小鼠骨髓基质细胞系,本文报道所建骨髓基质细胞系BMSC1,并对其进行了细胞学鉴定分析。     

骨髓来源干细胞在肝移植中的应用及其相关机制

肝脏移植已经日益成为治疗终末期肝病最为有效的方法, 而供肝严重短缺、急慢性排斥反应以及长期应用免疫抑制剂所带来的毒副作用一直是肝移植面临的三大难题. 骨髓来源的干细胞具有向肝系细胞分化的潜能, 参与损伤后肝再生. 肝移植术后, 急性排斥反应、缺血再灌注、部分肝移植肝量损失、术后肝炎复发及“小肝综合征”等对移植肝造成的损伤环境可对骨髓来源不同干细胞亚群产生趋化作用, 动员其进入外周循环并迁移至肝脏, 促进移植肝功能修复. 此外, 骨髓来源干细胞还可参与活体肝移植供者的功能性肝再生. 骨髓源干细胞参与肝再生的过程可能是通过SDF-1及其受体CXCR4的相互作用以及HGF, IL-8, MMP9, VEGF/VEGFR-2等因子的参与而实现的. 肝移植联合供者来源的骨髓源干细胞移植可以诱导供者特异性免疫耐受, 使异体移植肝得以长期高质量存活. 总之, 无论是从参与再生的角度还是从诱导免疫耐受的角度, 无论从受者的角度还是从活体供者的角度, 骨髓来源的干细胞移植都显示了辅助肝移植治疗肝衰竭, 进而拓宽肝移植发展空间的强大优势, 为广大肝病患者带来新的希望.     

LiCl对大鼠MSCs的动员效应及动员后细胞的分化潜能研究

为探讨LiCl动员间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的效应及动员后细胞的神经分化潜能. 用LiCl动员大鼠后, 以CFU-F分析其动员效应, 从形态学、表型分子的检测等对动员MSCs鉴定. 用b-巯基乙醇和神经元原代培养上清液诱导动员后MSCs向神经元分化. 结果表明, CFU-F分析显示LiCl可有效动员外周血MSCs, 形态学、表型分子等实验证实动员的细胞为MSCs, 并可被b-巯基乙醇和神经元原代培养上清液诱导, 表达神经元特异标志分子NSE, NF, Nestin和NeuN. 全细胞膜片钳记录到诱导后的MSCs有内向钠电流. 研究表明, 循环MSCs可被LiCl动员, 并在一定的环境下向神经元细胞分化, 这为神经损伤的修复提示了广阔的前景.     

小鼠胸腺基质细胞诱导Pre—T细胞的分化

体内重建试验证明,骨髓来源的 Pro-T 细胞,在胸腺内经历多阶段的发育,分化为对自身抗原耐受、对外来抗原应答的功能成熟 T 细胞,迁出胸腺.经嵌合小鼠及转基因小鼠研究证明,胸腺微环境基质细胞(TSC)对胸腺内 T 细胞的发育,有选择作用,阳性选择导致 T 细胞功能发育,阴性选择导致 T 细胞克隆消除或不活化.鉴于 TSC 类型的多样性,很难分析胸腺内起选择作用的细胞类型及分子机理.为此,体外建立 TSC 系,在体外培养中,分析已知类型的 TSC 对特定发育阶段的 T 细胞分化的作     

小鼠Th1细胞最佳分化需要STAT1信号转导

尽管IFN-γ单独不能触发Ⅰ型T辅助细胞(Th1)分化, 但IFN-γ信号缺失却会导致缺陷的Th1细胞表型: IFN-γ受体缺失(Ifngr^-/-)的Th1细胞不能永久地抑制IL-4的表达; 在Th2诱导条件下, 它们能分化成产生IL-4的细胞, 说明IFN-γ在Th1细胞中沉默Il4基因和稳定Th1细胞表型过程中起着关键作用. IFN-γ信号可能通过抑制STAT6磷酸化来抑制IL-4的表达. 作为介导IFN-γ信号转导的下游分子, 本研究的目的是研究STAT1在Th1细胞中抑制IL-4表达的可能机制. 研究结果显示, STAT1缺失的幼稚CD4+ T细胞中IFN-γ表达水平降低, 而IL-4表达水平升高. 这些细胞在非极性条件下趋向于分化成Th2细胞. 在Th1诱导条件下, STAT1缺失的幼稚CD4+ T细胞呈现缺陷的Th1分化: Stat1^-/- Th1细胞中IFN-γ和T-bet表达水平都降低; 这些细胞也不能抑制IL-4和GATA-3的表达, 并且保留了STAT6信号转导. 更重要的是, 在Th2诱导条件下, Stat1^-/- Th1细胞能高效地被转化成产生IL-4的细胞. 在Stat1^-/- Th1细胞中异位表达的T-bet能明显地抑制这种转化的能力, 并显著恢复IFN-γ表达. 这说明STAT1可能通过维持T-bet的表达来抑制IL-4的表达. 最后, 在Stat1^-/- Th1细胞中观察到位于Il4基因两个增强子区域的组蛋白H3乙酰化(H3^AC)和组蛋白H3赖氨酸K4二甲基化(H3K4dim), 提示这些细胞中的Il4基因位点可能处于开放的状态. 研究结果显示, 在Th1细胞中STAT1信号可能介导Il4基因抑制的新机制: 上调T-bet从而抑制GATA3和IL-4表达、抵抗STAT6信号转导, 并抑制Il4基因位点表观遗传修饰.