利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗β-地中海贫血的最新进展

地中海贫血是β-珠蛋白基因(HBB)点突变或缺失引起的单基因遗传病,患者产生溶血性贫血,其生存主要依赖于反复输血及去铁治疗,最终导致多器官受损、衰竭,给个人、家庭和国家带来严重的经济负担.随着基因编辑技术的蓬勃发展,可能治愈基因突变性疾病的基因治疗应运而生,其中CRISPR/Cas9基因编辑技术凭其靶向特异性、经济性等优势备受关注,并已广泛应用于分子生物学以及生命科学领域的研究.如今CRISPR/Cas9基因编辑技术修复人多能干细胞HBB基因、诱导胎儿血红蛋白(HbF)合成或抑制α-珠蛋白基因(HBA基因)表达是治愈β-地中海贫血的三大可行性策略,相关临床试验已相继开展.本文就CRISPR/Cas9系统的研究进展、作用机制以及在治疗β-地中海贫血的最新研究与应用进行综述,涉及细胞实验、动物模型、临床试验等内容,并介绍了CRISPR/Cas9系统衍生的新型基因编辑工具碱基编辑器在该领域的研究应用,为促进β-地中海贫血从基础研究转向临床治疗提供新的思路和方向.     

中国人β-珠蛋白基因簇的多态性和单体型

对10例中国人正常受试者和15例重型β-地中海贫血患者及其双亲的β-珠蛋白基因簇的8个限制性内切酶切点多态性和单体型进行分析，     

地中海贫血与基因体外放大技术

地中海贫血是常见的遗传性疾病,在地中海沿岸国家及我国南方携带地中海贫血基因者比例很高。早已知道地中海贫血是由于组成血红蛋白的某一条链合成障碍引起的。正常成人HbA是两条α链和两条β链组成的。α链和β链在正常人中是以等速度合成的,形成的血红蛋白为α_2β_2(HbA)。当两条链合成速度不等时,     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

发育时期专一性相关的调控因子与人体ε-珠蛋白基因5′旁侧调控元件DNA的结合

人体ε-珠蛋白基因是人体β-类珠蛋白基因簇中胚胎型结构基因,在胚胎发育过程中,它最先在卵黄囊血岛中表达,也最先关闭,呈现出严格红系组织特异性和发育时期专一性特点.最近有人报道,人ε-珠蛋白基因5’旁侧DNA序列对人ε-珠蛋白基因时空表达和调控起着很重要的作用.已鉴定出位于该基因5’旁侧DNA序列内,从-535bp到-453bp为一个正调控元件(PRE),从-392bp到-177bp为一个沉默子(Silenecer)(图1).但目前尚不清楚它们作用的分子机制.     

与人β-珠蛋白基因5＇旁侧序列内负调控元件(NCR2)相结合的调控因子

人体β类-珠蛋白基因簇是研究真核基因表达时空秩序性的一个理想模型,在胚胎发育过程中,它的几个结构基因(ε,~Cγ,~Aγ,δ和β-珠蛋白基因)分别在不同的时期和部位开启和关闭。基因的激活与关闭在细胞分化和胚胎发育过程中都具有十分重要的意义,但有关它们的分子机制目前仍不很清楚。成年型的β-珠蛋白基因在胚胎期不表达,出生后主要在人的骨髓中表达,这一事实说明在胚胎期与胎儿期存在某种调控机制抑制了β-珠蛋白基因的开启。     

血红蛋白H病的产前诊断

血红蛋白H(HbH)病是我国南方常见的一种血红蛋白病,在缺失型HbH病患者的细胞中,4个α珠蛋白基因缺失3个,因此α珠蛋白链的合成严重减少,β珠蛋白链的合成便相对过剩,结果多余的β链聚合成血红蛋白H     

中国人β类珠蛋白基因多态性研究——γ珠蛋白基因中的多态性Hind Ⅲ酶切位点

人类珠蛋白基因多态性作为一种遗传标志,在人类学、遗传学和某些遗传性疾病的预防研究中具有重要的意义。国外自1978年开始发表一些种族群体分析的有关资料,国内在这方面迄今尚无研究报道。我们在研究我国β-地中海贫血(一种遗传病)产前诊断的过程中,首先对中国人β类珠蛋白基因的多态性限制性内切酶酶切位点的分布作了系统的研究。本文首次报告中国人群中γ珠蛋白基因多态性的资料。     

应用DNA体外扩增和寡核苷酸分子杂交技术研究中国人的β-地中海贫血突变类型

β-地中海贫血是我国常见的一种遗传性单基因病。目前世界上已发现60多种不同类型的β-地中海贫血基因,而每一民族和群体具有其特定的突变类型。因此开展对β-地中海贫血突变及其分布的研究对阐明疾病的发生、民族的关系、人群的迁涉以及对β-地中海贫血的防治等均具有十分重要的意义。本文报告用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)体外DNA扩增法结合寡核苷酸分子杂交技术,鉴定和分析了来     

小鼠β-簇珠蛋白基因LCR调控元件中DNase-I超敏感点Ⅲ(HS3)的研究

<正>人与小鼠β-簇珠蛋白基因在结构与表达模式上存在极大的相似性.基因簇5’上游20kb内是一个Locus control region(LCR)顺式元件,由4个DNase-Ⅰ超敏感区(HSs)组成.相关的研究工作表明LCR对β-簇珠蛋白基因的红系组织专一性表达有重要作用,它的插入或缺失突变将导致基因表达的紊乱,甚至造成严重的贫血症状.近年来,人们对研究LCR调控元件在β-簇珠蛋白基因发育时期特异性表达中的调控机制给予了极大的关注.希望了解LCR元件中不同的HS是否参与β-簇珠蛋白基因的时期特异开关调节.转基因小鼠研究结果表明人LCR元件中HS3可能与发育早期的胚胎型珠蛋白基因的表达调控相关,但近来有关报道表明小鼠的HS3不为β-簇珠蛋白基因的开关所必需,并且仅部分参与了成年型的β-簇珠蛋白基因的调控.因此,HS3是否参与β-簇珠蛋白基因发育时期特异性的调控尚不完全清楚.     

一种新的β地中海贫血突变类型——Cap位点下游4bp(AAAC)缺失

β地中海贫血(简称β地贫)是一种常见的遗传性血液病,由于β珠蛋白基因突变所致.我们在研究中国不同地区β地贫的分子缺陷的机理时,发现了一种新的突变类型,现     

用合成的寡核苷酸探针鉴定中国人β地中海贫血基因突变

由于大多数的β地中海贫血(β~T)突变都是点突变,我们可以人工合成对β地中海贫血基因特异的寡核苷酸来直接检测突变基因。本工作通过合成六种与β地中海贫血突变基因同源的及六种与相应的正常基因同源的寡核苷酸,并用这些寡核苷酸作为DNA     

人的DNA指纹

一、引言遗传标志(genetic marker)是任何遗传学分析的基础。一直到70年代末,几乎所有的生化标志(biochemical marker)仅限于蛋白质的多态性(例如,若在血中出现大量的HbA(?)或大量的HbF,则可诊断为β地中海贫血)。随着DNA克隆技术和Southern杂交技术的应用,在基因组DNA水平上直接分析变异性(variability)成为可能.最初通过β珠蛋白基因族中限制性内切酶酶切片段长度变异的分析(例如,经Bam HI限制酶切割后,β~0地中海贫血患者出现含β     

在我国发现一例新型异常血红蛋白

近二十年来,异常血红蛋白的研究受到医学、遗传学、人类学等方面的高度重视。世界卫生组织已把血红蛋白病(包括地中海贫血)列为世界六大疾病之一。据统计,至今已发现异常血红蛋白变种约三百五十种。本文报告一例新型血红蛋白,并定名为血红蛋白——双峰(Hb Shuangfeng)。患者邓××,男,24岁,汉族,某部战士,祖籍湖南省人。因溶血性贫血先后两次入院检查治疗。碱     

反义核酸对β-地中海贫血基因(IVS-2-654 C→T)剪接缺陷抑制作用的研究

β-珠蛋白基因第2个内含子(IVS-2)中第654位核苷酸(nt654)C→T剪接缺陷型突变是中国人最常见的β-地中海贫血(简称β-地贫)突变类型之一.我们先前的研究表明,该突变在IVS-2第654位(nt654)上出现的单碱基取代产生了一个新的 GT二核苷酸,它联同旁侧序列构成了一个5＇异常剪接位点,同时还激活了IVS-2第579位(nt579)处3＇隐匿剪接位点,从而将 IVS-2nt580至 nt652之间一段73bp内含子序列作为额外的外显子插入外显子2和外显子3之间,产生了异常的β-珠蛋白mRNA,导致β~ -地贫.为了探讨反义核酸治疗β-地贫IVS-2-654 C→T突变的可能性,我们应用体外转录和体外剪接系统,以体外转录产生的特异反义RNA封闭IVS-2-654 C→T突变基因中3＇隐匿剪接位点和5＇异常剪接位点,使之失去活性,从而减少异常加工的mRNA并且部分恢复了正常剪接途径.     

胎儿血红蛋白再生治疗β-血红蛋白病

 β-血红蛋白病是世界上最常见的遗传疾病,该病最初的治疗策略为病毒载体介导的基因治疗,但由于花费昂贵、疗效有限、存在安全隐患等问题进展缓慢。近些年,基因组编辑技术成为开发β-血红蛋白病新型治愈方案的有力工具。文章回顾了胎儿血红蛋白再生策略治疗β-血红蛋白病的最新进展,其中破坏BCL11A红系增强子的方式因其安全、有效、临床价值高而备受青睐。β-血红蛋白病基因治疗策略的下一步发展值得期待,有望完全治愈β-地中海贫血和镰状细胞贫血症这两种遗传性血液病。     

遗传学家查明大鼠细胞的缺陷

伦敦的胚胎学家已经找到了一种完善的方法来确定单细胞内单基因的缺陷。这个由伦敦医学研究院哺乳动物研究室的凯西·赫尔汀和马里林·蒙克获得的成果为实验室阶段人类胚胎遗传疾病的诊断铺平了道路。赫尔汀和蒙克使用了一种称为多聚酶连锁反应(PCR)的新技术来复制单个的指导合成β-主血红蛋白的基因。这种蛋白是血液中担负着氧的输送的血红蛋白的基本组分。患β-地中海贫血症的人,这个基因发生了突变,因而就合成出一种有缺陷的蛋白质或者根本不合成蛋白质。     

HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子DNA的相互作用

HMG (high mobility group)蛋白质是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白, 它们在染色质的结构与功能及基因表达调控中起着重要作用. 应用凝胶电泳阻滞法和体外核小体重组技术, 分析了HMG1/2和HMG14/17与人ε-珠蛋白基因启动子(ε-promoter,-177 ～ + 1 bp) DNA的结合模式. 实验结果表明, HMG1/2能与ε-珠蛋白基因启动子DNA相结合, 而HMG14/17不能与它结合. 将ε-珠蛋白基因启动子DNA在体外组装成核小体后, HMG1/2则不能与组装成核小体的ε-珠蛋白基因启动子 DNA结合, 而HMG14/17却能与之结合. 结果提示, 当 ε-珠蛋白基因启动子DNA处于不同的状态时, 它所结合的HMG蛋白是不同的, 推测它们可能就是通过这种选择性的结合模式而积极参与了人体 ε-珠蛋白基因的表达调控.     

β-珠蛋白基因——至少有两个插入DNA

关于β—珠蛋白mRNA的结构,已经了解得相当详细,如已知其5′端有甲基化的封闭结构,3′端有多聚A,还知道翻译部分的核苷酸序列与氨基酸序列相互对应等。与此相反,关于β-珠蛋白基因的结构及存在方式却了解得极少。但自从蒂尔门(Tilghman)等人对鼠β-珠蛋白基因进行无性繁殖以来,这方面的研究取得了迅速的进展。他们首先揭示出β-珠蛋白基因的核苷酸序列与成熟mRNA的核苷酸序列不完全对应,证明基因内至少有两个插入DNA。     

用Y染色体特异的DNA探针于妊娠早期鉴定胎儿性别

重组DNA技术已应用于多种遗传病的产前诊断,并成功地用来鉴定胎儿的性別,国内已运用这种技术进行α-和β-地中海贫血的产前诊断,但是胎儿性别的鉴定仍沿用染色体分析,本文介绍用Y染色体特异DNA探针于妊娠早期鉴定性别。本法具有快速、灵敏等优点,对于X-连锁遗传病的产前诊断具有重要价值。