光敏色素B介导光信号影响水稻的脱落酸途径

研究表明,拟南芥中光敏色素介导的光信号与植物激素脱落酸(abscisic acid,ABA)途径相互作用.但水稻光敏色素与ABA途径之间是否相互影响仍不清楚.利用野生型和phyB突变体水稻作为研究材料,分析phyB介导的光信号对ABA生物代谢和ABA反应的影响.结果表明,ABA合成代谢相关基因OsNCED1,OsNCED2,OsNCED3和OsNCED4在phyB突变体中的表达水平明显高于野生型,而ABA降解代谢基因OsABAOX1则相反,这可能解释了phyB突变体积累较多内源ABA的原因.外源ABA处理明显抑制黑暗和光照下生长的水稻种子的萌发,但光照条件下ABA对phyB突变体种子萌发的抑制效果更明显.据此推测,phyB感受的光信号消弱了ABA对种子萌发的抑制效果.通过分析部分已报道的种子萌发相关基因在正常或ABA处理的野生型和phyB突变体中的表达水平,结果表明,phyB介导的光信号对水稻种子萌发的调控作用可能与这些基因无关.此外,在红光条件下,ABA处理能够抑制水稻幼苗地上部分的生长,野生型和phyB突变体对ABA处理的反应基本相同;但是ABA对phyB突变体主根生长的抑制效果显著高于野生型,这个结果表明phyB介导的光信号不影响ABA对水稻幼苗地上部分生长的抑制效果,但负调控ABA对主根生长的抑制效果.上述研究结果表明,phyB介导的光信号负调控水稻ABA的积累和ABA反应.本研究揭示了水稻光敏色素对ABA途径的影响,为深入研究光信号途径和ABA途径之间协同调控水稻发育的分子机制奠定了基础.     

光敏色素影响赤霉素调控的水稻幼苗光形态建成特征

赤霉素(gibberellin, GA)是一种重要的植物激素, 它与光敏色素协同调节拟南芥植株的光形态建成特征. 但是GA对水稻幼苗光形态建成和暗形态建成的影响, 特别是在此过程中光敏色素与GA之间的相互作用仍不清楚. 本研究利用野生型和光敏色素突变体(phyA和phyB)水稻作为研究材料, 分析了GA生物合成抑制剂多效唑(PAC)对黑暗和光照下生长的水稻幼苗胚芽鞘、地上部分和主根延伸以及光调控基因LHCB表达的影响. 据此推测, 在暗生长条件下, PAC处理能够抑制野生型水稻幼苗胚芽鞘的生长, 诱导LHCB基因的表达; phyA突变体对PAC处理的反应不如野生型敏感; phyB突变体和野生型反应基本相同. 在光照条件下, PAC处理能够抑制水稻幼苗地上部分的生长, phyB突变体对PAC处理的反应不如野生型和phyA突变体敏感. 此外, phyB介导的光信号负调控PAC诱导的主根延伸反应. 据此推测, GA是维持水稻幼苗暗形态建成、抑制光形态建成所必需的; 另一方面, phyA和phyB或正或负调控PAC所诱导的光形态建成反应. 本研究结果揭示了光敏色素和GA在水稻幼苗生长发育中的相互作用, 为进一步研究光和GA协同调控水稻发育的分子机制奠定了基础.     

水稻三角颖突变体tri1的遗传分析与基因克隆

籽粒形状与大小是影响水稻产量和品质的重要因素. 本研究在经⁶⁰Co-γ射线辐射粳稻品种台北309的后代中分离获得一个三角颖突变体tri1(triangular hull 1). 与野生型相比, tri1籽粒颖壳呈三角形, 粒厚增加, 蛋白质含量升高, 株高和千粒重降低. 遗传分析表明, 该突变性状能稳定遗传, 受一对隐性核基因控制. 采用图位克隆法将目的基因精细定位于水稻第1染色体长臂上分子标记CHR0122与CH0127之间, 物理距离约47 kb, 并与分子标记CHR0119共分离. 在该区域内共有6个候选基因, 测序分析表明tri1突变体中一个释义基因OsMADS32的第3外显子内缺失了一个碱基A, 导致移码突变和翻译提前终止; RT-PCR分析表明, OsMADS32主要在水稻幼穗中表达, 在根、茎、叶和发育的种子等组织中的表达量极低, 说明OsMADS32基因与花的发育与关. 据此, 推测OsMADS32基因可能为TRI1的候选基因.     

大豆早期结瘤素基因enod2B启动子在水稻中的表达受结瘤因子诱导

在根瘤菌与宿主豆科植物形成的共生关系中, 根瘤菌分泌的结瘤因子是宿主专一性的主要决定因子. 结瘤因子信号能够诱导豆科植物根毛细胞质膜去极化、离子流动和早期结瘤素基因的表达以及根毛变形、皮层细胞分裂和根瘤原基形成等与共生有关的表型变化. 水稻是重要的粮食作物, 能否对结瘤因子信号产生应答反应是最终实现水稻结瘤固氮的关键因素. 将大豆早期结瘤素基因Gmenod2B的启动子与报告基因b-葡萄糖苷酶(GUS)基因融合构建成嵌合基因Gmenod2BP-GUS, 以此嵌合基因作为探索水稻细胞感受结瘤因子信号的分子标记. 通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统, 获得了携带嵌合基因Gmenod2BP-GUS的水稻再生植株. 以广宿主根瘤菌NGR234(pA28)分泌的结瘤因子作为探针, 检测转基因水稻中嵌合基因Gmenod2BP-GUS的表达. 结果表明, 转基因水稻中大豆早期结瘤素基因enod2B启动子的表达可以受结瘤因子诱导, 仅在水稻根部的皮层薄壁细胞和内皮层细胞中呈特异性表达, 并且受到氮源的调控. 推测在水稻中可能存在结瘤因子所诱导的豆科早期结瘤素表达的类似机制.     

渗透胁迫调节拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶3的基因表达

以拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶3 (ATGPX3)的T-DNA插入突变体和转ATGPX3启动子GUS融合基因植株为材料, 深入分析了ATGPX3基因表达及其在渗透胁迫信号转导中的作用. 甘露醇渗透处理后, 与野生型拟南芥相比, ATGPX3基因突变体(atgpx3-1)的生长和发育明显受到了抑制; 并且渗透胁迫也提高了ATGPX3-GUS融合基因的表达. 在植物激素ABA诱导下, RD29A, ABI1, ABI2和RbohD等基因在atgpx3-1突变体中出现了不同程度的表达. 以上结果提示, ATGPX3可能参与了渗透胁迫反应的调节.     

低频、低压交变电场高效诱导基因转移

电场诱导基因转移以操作简单、转化率高、无细胞种属限制等优点被广泛应用到微生物、植物及动物细胞的基因转移中,其基本原理是:利用高压电脉冲造成膜的瞬间击穿,在膜上形成数纳米的孔洞,外源基因得以扩散进入胞内,从而实现外源基因的跨膜转移。这种穿孔在一定条件下是可逆的,但往往会造成50％左右的细胞的死亡。1990,Tsong首次报道了利用低频、低压交变电场将外源质粒DNA高效导入E. coli中,并发现交变电场作用后,且coli细胞100％存活,此后这方面的报道较少,更没有用到高等哺乳动物细胞的基因转移中。我们对真核细胞衣藻和Hela细胞分别以带有报告基因GUS的质粒pBI121、带有报告基因β-Galatosidase的质粒pSV-β-Gal作为模式外源基因进行了交变电场诱导基因转移的研究,结果分别得到了GUS基因、β-Gal基因的高效表达。     

液泡定位的β-葡萄糖苷酶增强拟南芥的耐旱性

植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)在植物生长发育及适应多种胁迫环境过程中发挥重要作用, 植物在应对这些不断变化的生理需求及环境条件时细胞内ABA 水平也发生相应的变化. 迄今为止, 人们还未完全了解植物体内ABA 水平的精细调控机制. 本文中, 我们的研究表明拟南芥中β-葡萄糖苷酶家族成员之一BGLU10 参与了植物的耐旱性反应. T-DNA 插入纯合突变体bglu10 表现出干旱敏感的表型, 包括快速的水分丧失, 叶片表面温度较野生型低,ABA 含量、β-葡萄糖苷酶活性及ABA 和干旱响应基因的表达量均低于野生型. 与bglu10 突变体相比, BGLU10 的超表达转基因植物比野生型耐旱性更强, 表现为较低的失水速率, 较野生型更高的ABA 含量、β-葡萄糖苷酶活性及ABA 和干旱响应基因的表达水平. 拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达结果证明BGLU10 蛋白定位于液泡中. 另外, BGLU10 基因在植物多种组织中均有表达, 且受多种非生物胁迫诱导表达, 这些结果暗示了BGLU10 可能在多种胁迫条件下水解ABA-葡萄糖苷(ABA-GE)释放自由ABA, 参与植物对这些胁迫的应答反应.     

一个具有棉花纤维细胞特异性的启动子SCFP

为了获得棉花纤维特异启动子, 克隆了棉花纤维细胞中表达基因GhSCFP的5′端上游序列, 将其分别与GUS和GFP报告基因融合. 在转基因烟草中, 仅在种皮的最外层细胞中检测到GUS和GFP活性; 在转基因陆地棉中, 根、叶片、幼茎、花冠、花药和柱头中均未观察到GUS信号, 而在开花当天胚珠表面突起的纤维细胞中有明显的GUS活性, 直到开花后36 d, 纤维上仍可观察到GUS信号. 本研究结果显示, SCFP启动子具有明显的棉花纤维表达特异性和植物种皮特异性, 而且表达强度高. 该启动子在棉花纤维发育相关基因的功能研究和棉花基因工程改良中将有重要的应用价值.     

转录辅因子CBP/p300提高转录因子C/EBP介导的人白细胞介素5(IL-5)基因启动子活性

IL-5主要由Th2类细胞产生, 在过敏性哮喘等过敏性疾病的发生过程中起着关键的作用. 转录辅因子CBP/p300本身具有组蛋白乙酰转移酶活性, 参与许多基因的转录调控过程. 腺病毒E1A癌蛋白能与CBP/p300蛋白结合并抑制其活性. 我们分析了E1A蛋白在IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因表达调控中的作用, 结果表明E1A蛋白能抑制PMA/离子霉素激活和转录因子C/EBPβ介导的IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的活性. 而突变体E1AΔ2-36蛋白因不能与CBP/p300蛋白结合而不能抑制IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的表达. 此结果揭示, 组蛋白乙酰转移酶CBP/p300参与IL-5基因启动子活性的调控. 另外, 转录辅因子CBP/p300和转录因子C/EBPβ可以协同地激活IL-5基因启动子/荧光素酶报告基因的表达. 为进一步研究IL-5基因表达调控的机制奠定了基础.     

水稻穗顶退化突变体paa1331的鉴定及基因定位

水稻穗部是影响产量的重要农艺性状,其发育健全与否直接决定了水稻产量的高低.过去几十年已经有大量的粒型和穗粒数相关基因被克隆报道,但调控穗顶发育相关基因的克隆与功能的报道较少.本研究通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻品种宜香1B,筛选到一个能稳定遗传的穗顶退化突变体材料paa1331(panicleapical abortion1331).与野生型相比,该突变体主要表现为穗顶端严重退化(退化率高达53%),株高变矮,分蘖减少,穗粒数降低.台盼蓝染色结果表明,穗顶端退化伴随细胞程序性死亡;激素测定结果证明,突变体穗顶部生长素含量高于野生型.遗传分析表明,该突变性状受隐性单基因控制;通过图位克隆与重测序分析发现,基因LOC_Os04g40720第4外显子的碱基A突变成G,导致编码的氨基酸由天冬酰胺变为天冬氨酸.目前该基因未见报道,暂将该基因定为候选基因.     

水稻生育后期卷叶突变体lrl1的鉴定及基因定位和候选基因预测

叶片是水稻主要的光合器官,适度卷曲有利于保持植株叶片直立而不披垂,增加中、下层叶片透光率,从而改善群体光照条件,是理想株型的重要组成,对水稻高产育种具有重要意义.利用甲基黄酸乙酯(EMS)诱变籼稻恢复系缙恢10号获得了一个遗传稳定的水稻生育后期卷叶突变体lrl1.lrl1的叶片在前期生长正常,从13叶龄开始,上三叶沿中脉向内卷曲,且随着生育期推进,卷曲度增加,在成熟期剑叶、倒二叶和倒三叶的卷曲度分别为73.66%,66.91%和45.81%.与野生型缙恢10号相比,除lrl1的千粒重(21.43 g)显著降低外,其他重要农艺性状均没有显著差异.lrl1的叶片小维管束间的泡状细胞数量减少、形状怪异、排列极不规则,导致小维管束之间的夹角变小,从而引起了其叶片的卷曲.lrl1的上三叶光合色素含量均显著高于野生型.但其功能叶净光合速率等均与野生型没有显著差异.经遗传分析和分子定位,该叶片卷曲受一对隐性核基因控制,位于第9染色体分子标记SWU-1和Ind6之间812 kb的区域.通过基因预测,在该区域共有129个候选基因,对其中3个可能与卷叶相关的基因测序,均未发现它们在lrl1与野生型间存在差异.以泡状细胞变化相关的6个卷叶基因在突变体lrl1中的real-time PCR分析表明,卷叶基因ROC5和RL14的表达明显上调,而ACL1,SRL1以及NAL7被下调,暗示了这些基因可能在同一通路上调控叶片的发育.该基因是一个新发现的基因,而且遗传行为简单,其相应突变体含有许多育种有利的性状,因而研究结果为该基因的克隆和功能研究及高产育种奠定了良好基础.     

拟南芥SRO1调节植物重金属汞胁迫应答

环境中重金属过量会限制植物的正常生长发育.本研究分离鉴定了一个拟南芥T-DNA插入突变体,其幼苗表现出对HgCl2高度敏感.分子遗传学分析发现该突变表型是SRO1基因突变所致;蛋白序列分析展示SRO1含有介导蛋白与蛋白互作的WWE结构域.进一步研究表明,sro1-1植株在HgCl2处理下,生长受到严重抑制,突变株表现出黄化、真叶减少等生长缺陷特征.电导率检测表明,突变体的细胞膜破坏比野生型更严重.利用DAB染色和激光共聚焦显微镜成像技术研究证明,突变体在重金属胁迫下积累更多的H2O2.定量RT-PCR证实在氧化和重金属胁迫下,sro1-1中一些与非生物胁迫相关的基因如APX1的表达明显受到抑制.GFP::SRO1转基因植物证明SRO1蛋白定位于细胞核中.另外,SRO1基因在植物多种组织中均有表达,且生长比较旺盛的组织表达水平更高.以上结果表明,SRO1基因在拟南芥响应重金属汞胁迫中发挥重要作用.     

水稻条纹窄叶突变体nsl1的形态和生理分析及基因定位

水稻(Oryza sativa L.)叶形和叶色直接影响光能利用,最终影响其产量和品质,是水稻重要的农艺性状.通过甲基磺酸乙酯诱变籼稻缙恢10号发现了1个遗传稳定的水稻条纹窄叶突变体,暂命名为nsl1.nsl1在苗期叶片呈浅白色,拔节期后出现平行于叶脉分布的白色条纹,而且其叶片显著窄于野生型缙恢10号.nsl1突变体的白色条纹部位细胞内部叶绿体严重解体,叶绿素含量显著下降.荧光参数F0,Fv/Fm,?PSⅡ,qP和ETR均显著低于野生型,光合效率显著降低.nsl1的叶形叶色及生理的变化最终引起nsl1突变体株型矮小和产量相关性状的明显减小.该条纹窄叶性状受一对单隐性核基因控制,被定位于第3染色体长臂InDel 16与InDel 12之间,物理距离为204 kb,在该区域尚未发现与已报道的叶色或窄叶相类似的基因.本研究为NSL1基因克隆和功能分析奠定了良好基础.     

利用安全性转基因技术导入反义蜡质基因降低稻米直链淀粉含量

利用安全性转基因技术中的共转化法, 将分别含有p13W₄双元载体(含有潮霉素抗性基因、gus报告基因以及反义蜡质基因片段)和p13W₈双元载体(无潮霉素抗性基因和gus报告基因, 只含有反义蜡质基因片段)的根癌农杆菌以1:9的比例混合导入超2-10高产水稻新品系中, 获得34棵转基因植株. PCR分析转基因T₀代植株, 结果显示, 有15株是共转化植株, 共转化率为44.1%. 利用p13W4双元载体上的gus报告基因从T₁代种子中淘汰具有报告基因及抗性标记基因的转基因后代, 再利用PCR检测从T₁代植株中获得只有反义蜡质基因的植株. Southern blot杂交分析证实, p13W₈双元载体T-DNA已整合进入无抗性标记及报告基因的转基因后代基因组中. T₂代成熟种子直链淀粉含量分析显示, 转基因植株糙米直链淀粉含量比对照有不同程度的下降, 幅度最大的比对照降低28.61%. 由于获得的转基因后代只有目的基因而无抗性选择标记基因和报告基因, 而且水稻中的稻米直链淀粉含量已降低, 它们既可被用于筛选软米材料, 也可视为是能够用于其他水稻稻米食味品质改良的水稻新资源.     

水稻籽粒灌浆突变体gef1的鉴定及其基因定位

籽粒灌浆是水稻(Oryza sativa)生长发育过程中极为重要的阶段,涉及复杂的遗传调控网络和环境互作,直接关系到水稻产量和品质的形成.本研究通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变籼稻品种宜香1B,筛选到一个能稳定遗传的籽粒灌浆延长突变体gef1(grain extended filling 1).与野生型相比,该突变体灌浆速率下降,灌浆延长约30 d,且籽粒变大,结实率下降.相关生理指标测定表明,突变体gef1在整个灌浆过程中光合同化物供应正常,但同化物的分配与转化效率较低.对突变体gef1组织细胞学观察发现,穗轴与茎秆部位的大维管束数量减少,表明同化物的运输效率降低是影响灌浆速率的原因之一;颖壳内表皮细胞纵向伸长且数量增多,推测籽粒大小的改变与细胞的数量及形状有关.基因表达分析表明,gef1影响籽粒中糖代谢相关酶的表达;遗传分析表明,该突变表型受单隐性核基因控制,利用图位克隆法将gef1基因定位于水稻第3染色体短臂标记InDel3-1与InDel3-2之间198 kb的范围内,在该区域内尚未有与水稻籽粒灌浆相关基因的报道.     

拟南芥DELLA下游的GASA基因表达研究

赤霉素(gibberellins, GAs)信号转导途径相关组分的分离与功能研究对于最终阐明GA作用机制十分重要, 目前赤霉素信号途径关键因子DELLA的下游组分研究较少. 拟南芥中受GA调控的GASA (GA-Stimulated in Arabidopsis)家族共有15个基因, 预测所有GASA蛋白的N端均有一可剪切的信号肽, C端含有12个半胱氨酸的GASA保守结构域. RT-PCR结果证实, 在DELLA突变体gai-t6和rga-24以及二者双突变体中, GASA4和GASA6的表达上调而GASA1和GASA9下调, 与GASA4和GASA6表达受外源赤霉酸(GA₃)促进而GASA1和GASA9表达受GA₃抑制的结果相一致. 除此之外, 其他一些GASA基因表达也分别受GA3和脱落酸(ABA)的独立或共同调控. 大部分GASA基因在根、茎、叶、花和幼嫩荚果中均有表达. 利用启动子驱动GUS报告基因的方法研究了GASA6, GASA7, GASA8, GASA9, GASA10, GASA11和GASA12等7个基因的器官表达特异性, 发现在生长分化旺盛的组织器官及离层区均有这些基因的表达, 可能与细胞的分裂和生长有关. 本研究为GASA基因家族在GA和ABA 信号途径中的功能研究提供重要依据.     

水稻包穗突变体esp2 的遗传分析与基因精细定位

水稻的包穗现象主要是由倒一节间缩短造成的. 阐明包穗形成的分子机制, 对解决水稻不育系的包穗问题, 创造水稻新种质具有重要意义. 我们在籼稻品种明恢86 的组织培养后代中获得了1 个包穗突变体, 命名为esp2(enclosed shorter panicle 2), 其穗部被剑叶叶鞘完全包裹, 倒一节间几乎完全退化, 而其余各节间长度则没有明显改变. 遗传分析表明, esp2 受一对隐性基因控制, 能稳定遗传且不受遗传背景的影响. 显然, ESP2 是控制水稻倒一节间发育的一个关键基因. 利用esp2 与粳稻品种秀水13 杂交的F₂ 群体以及SSR 和InDel 标记, 将ESP2 精细定位在1 号染色体短臂末端一个14 kb 的区域内. 根据水稻基因组序列的注释, 该区域内只存在1 个完整的基因, 亦即一个假定的磷脂酰丝氨酸合成酶(putative phosphatidylserine synthase)基因. 对野生型和突变体的测序分析结果表明, 该基因内部插入了一个5287 bp 的反转座子序列. 因此, 我们将该基因作为ESP2 的候选基因. 本研究结果为ESP2 基因的克隆和功能分析奠定了基础.     

苜蓿中华根瘤菌烯脂酰ACP还原酶基因fabI1的功能研究

我们先前的工作表明, 苜蓿中华根瘤菌的烯脂酰ACP还原酶基因fabI1在nifA突变根瘤中表达水平降低. 本研究构建了fabI1的定点插入突变体. 与野生型相比, 突变菌株的生长速度变慢, 在高浓度NaCl培养基上的生长能力降低. 在半固体培养基上, 该突变体的涌动能力完全丧失. 在共生过程中, 突变菌株在宿主植物上延迟结瘤, 形成根瘤的能力下降. 虽然苜蓿中华根瘤菌中的烯脂酰ACP还原酶基因fabI2的序列与fabI1有66%的一致性, 但fabI2不能恢复fabI1突变体的表型, 揭示了这两个基因在功能上的差异.